微衛(wèi)星分子標記開發(fā)操作指南

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1、微衛(wèi)星分子標記開發(fā)操作指南1、250ngDNA酶切(DNA必須比較純)反應體系:ddH2017.25μL10XbufferR2.5μLMseⅠ(10U/μL)0.25uL(2.5U)DNA(50ng/μL)5μL總反應體系25μL,PCR儀內(nèi)37℃,3h酶切,65℃,15分鐘失活。電泳檢測:1.5%的瓊脂糖,150V電泳20min,點樣量約9μL-10μL,剩余的15μL用于連接。2、酶切后的產(chǎn)物連接。反應體系:ddH208.8μLMseⅠ接頭1uM(3μL)即1pmol/μL0.405nmol/μl=405pmol/μlT4buffer3μLT4DNAligase(5U/μL)0.2μL(

2、1u)酶切后DNA15μL總反應體系30μL,PCR儀內(nèi)37℃,2h或21℃,過夜連接,65℃10min失活。MseⅠ接頭5’-TACTCAGGACTCAT-3’/5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’接頭:10μL100pmol/μL+90μLddH2O=100μL10pmol/μL3、連接的產(chǎn)物用滅菌蒸餾水稀釋10倍(10μL酶切產(chǎn)物+90μL水)4、稀釋的連接產(chǎn)物預擴增。反應體系:無菌水9.6μLTaqDNA聚合酶buffer1X2μLMgCl21.5mM2μLMseⅠ-Nprimer120ng1μLdNTPs200uM0.2μLTaqDNA聚合酶0.4U0.2μL稀釋的連接產(chǎn)物

3、5μL5μL總反應體系20μL。反應條件為:94℃30s,53℃60s,72℃60s,14-26個循環(huán)(循環(huán)數(shù)需優(yōu)化14-17-20-23-26)MseⅠ-N引物為:5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’,N表示包括所有4種可能的選擇堿基N=A,T,C,G,1.5%瓊脂糖電泳檢測5、最佳反應條件下,PCR重新擴增一次,獲得幾百ng的擴增產(chǎn)物,試劑盒純化。6、雜交*5’端生物素化的探針的選擇:常見的幾種探針:(AC)15,(CT)15,(GA)15,(CAA)10,(AAG)8,(GATA)7,(ACCT)6*250ng-500ng擴增的DNA與50-80pmol的生物素化的探針混合,

4、加入總體積100μL的SSCX4.2和SDS0.07%中(即21μLSSCX10加0.7μLSDS10%,加水至100μL)。2μg的DNA與200pmol的探針在終體積500μL終濃度0.5XSSC溶液中,60℃雜交2小時。*95℃3min變性,室溫,15min退火7、富集純化的帶接頭的DNA(2-2.5微克)約30-50μL,95℃變性5分鐘,與3’端生物素化的(CA)10或(GA)10或5’生物素化探針(60℃雜交2h)200pmol(1μL)在50℃0.5倍SSC雜交1.5h,加入600μL的磁珠重懸于100μL的0.5XSSC溶液中,室溫,20分鐘。300μL的預熱至50℃的0.1

5、XSSC溶液洗2次300μL的0.1XSSC溶液室溫洗2次DNA洗脫至100μL的預熱至50℃的雙蒸水中,2次試劑盒操作說明:輕彈管底,使磁珠重懸,用磁場吸附磁珠,小心去上清(不能離心!!)用300μL的0.5XSSC溶液重懸并清洗磁珠,磁場吸附,去上清(重復2次)重懸于100μL的0.5XSSC,加入DNA探針混合物室溫溫育10分鐘,每1-2分鐘,倒置管子混勻吸附磁珠,去上清300μL的0.1XSSC溶液重懸并清洗磁珠,磁場吸附,去上清。重復3次,最后一次去上清盡量去干凈(洗完后的上清保留以便查找實驗故障的原因)重懸于100μL的水中,輕彈管底是磁珠重懸磁場吸附磁珠,上清液(我們需要的產(chǎn)物

6、)轉(zhuǎn)移至滅菌的管子中,保留磁珠。加入150μL的水,重復洗脫一遍,共得到250μL的產(chǎn)物富集*1mg的磁珠用TEN100(10mMTris-HCl,1mMEDTA,100mMNaCl,pH7.5)沖洗,重懸于40μL的TEN100中。*加入10μL(約1ug)的不相關(guān)的PCR產(chǎn)物(為了盡量減少非特異性結(jié)合的DNA)*DNA-探針混合物用300μL的TEN100稀釋*稀釋的DNA-探針混合物加入洗好的磁珠,室溫溫育30min,溫育過程中不時溫和攪拌(Incubateonrotator,orsidewaysinorbitalshakeronslowspeedat50for30min.)*1500

7、0轉(zhuǎn),離心1min,(以便查找失敗原因)*非嚴格沖洗:加入400μL的TEN1000((10mMTris-HCl,1mMEDTA,1MNaCl,pH7.5),室溫下輕柔混合5min,15000轉(zhuǎn),離心1min,上清轉(zhuǎn)移至另一管中保存?zhèn)溆谩V貜?次。*嚴格沖洗:加入400μL的SSC0.2X,0.1%SDS,室溫下輕柔混合5min,15000轉(zhuǎn),離心1min,上清轉(zhuǎn)移至另一管中保存?zhèn)溆谩V貜?次。8、加入50μ

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