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《重組創(chuàng)傷弧菌溶細胞素單克隆抗體的制備論文》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在學術論文-天天文庫。
1、重組創(chuàng)傷弧菌溶細胞素單克隆抗體的制備論文張琦，盧改娜，謝旦立，甄偉春，樓永良【摘要】目的?：制備重組創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(rebinantVibriovulnificuscytolysin，rVVC)鼠源性單克隆抗體，并對其特異性及免疫球蛋白類型進行鑒定，為創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(Vibriovulnificuscytolysin.freelonoclonalantibodyagainstrebinantVibriovulnificuscytolysin(rVVC)munoglobulinentofrapiddetectionkitofVibriovulnificuscy
2、tolysin.Methods:?IPTGmuneBALB/c.TheeffectsofexpressionandpurificationofrVVCinedbySDS-PAGE.Thehybridomacelllinestosecreteanti-rVVCmonoclonalantibodiesatechniqueandELISA，andtheniteddilution.Doubleimmunodiffusionassayonoclonalantibody.ELISAanddoubleimmunodiffusionassayinethespecificity.
3、Results:?ThemiceimmunizedbyrVVCdilutionto1:12?800byELISA.Taonoclonalantibodies.Themonoclonalantibodiesshootherbacteria.Conclusion:?BALB/cmiceissuccessfullyimmunizedandtouse-originhybridomacelllinesnamedB2C7andE3F4onoclonalantibodiesagainstrVVCareacquired.Thetypeofmonoclonalantibodyag
4、ainstrVVCisIgG1.Keya;monoclonalantibody創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus，Vv)是一種有莢膜的革蘭陰性嗜鹽弧菌，主要存在于海水及海產(chǎn)品中，可引起原發(fā)性敗血癥和嚴重的創(chuàng)口感染1-2。近幾年，浙江沿海、深圳也時有報道該菌感染病例，已引起很多專家學者關注。創(chuàng)傷弧菌可能包含諸多毒力因子3，溶細胞素是其唯一分泌至胞外具有種特異性的膜成孔類外毒素4，可作用于多種靶細胞誘導細胞凋亡、壞死，引起細胞炎癥反應等5-6。此外，體外重組的創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(rebinantVibriovulnificuscytolysin，rVVC)亦具
5、有典型的細胞毒活性，能引起人ECV304細胞凋亡7，誘導人SMMC7721細胞產(chǎn)生細胞應激，上調(diào)其TNF-α和HSP90的表達8。目前，有關創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(Vibriovulnificuscytolysin，VVC)抗體的研究較少，姚蔚等9曾利用體外rVVC制備了其多克隆抗體，并證實該多抗能阻斷rVVC對SMMC7721的細胞毒作用，為保護性抗體。而單克隆抗體相比多克隆抗體，具有更高的特異性。因此，本研究中，我們采用Ni2+-NTA親和層析法純化原核表達的rVVC，采用雜交瘤技術制備鼠源性rVVC單克隆抗體并進行免疫學鑒定，以期為VVC致病機制的深入研究及創(chuàng)傷
6、弧菌引起的食品污染中溶細胞毒素的快速檢測試劑盒研發(fā)奠定基礎。1??材料和方法1.1??材料1.1.1??細胞系、菌種及質(zhì)粒：小鼠骨髓瘤SP2/0細胞系購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。E.coliBL21(DE3)pET28a(+)-vvhA由本實驗室構建完成及保存。1.1.2??實驗動物：清潔級雌性6周齡BALB/c小鼠購自中科院上海實驗動物中心(上海斯萊克實驗動物有限公司)，許可證號：SCXK(滬)2007-0005。1.1.3??主要試劑：Ni2+-NTA親和層析樹脂購自上海申能博彩生物科技有限公司。異丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)購自寶生物
7、工程(大連)有限公司。還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSH)、鹽酸胍及精氨酸購自BBI公司。HRP標記羊抗小鼠IgG、TMB底物顯色液購自天根生化科技(北京)有限公司。優(yōu)級胎牛血清購自杭州四季青生物材料有限公司。RPMI1640購自Hyclone公司。PEG6000、HT和HAT培養(yǎng)基購自SIGMA公司。PEG2000購自上海生工。1.2??方法1.2.1??rVVC的表達、純化及復性：將pET28a(+)-vvhA-E.coli接種于含有卡那霉素(終濃度為25～30μg/mL)的固體培養(yǎng)基中37℃孵育，挑取生長菌落至含有卡那霉素(同上)的LB液體
8、培養(yǎng)基37℃搖床培養(yǎng)。測
