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《重組創(chuàng)傷弧菌溶細胞素單克隆抗體的制備》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、重組創(chuàng)傷弧菌溶細胞素單克隆抗體的制備：張琦，盧改娜，謝旦立，甄偉春，樓永良【摘要】目的?：制備重組創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(rebinantVibriovulnificuscytolysin，rVVC)鼠源性單克隆抗體，并對其特異性及免疫球蛋白類型進行鑒定，為創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(Vibriovulnificuscytolysin，VVC)致病機制的后續(xù)研究及創(chuàng)傷弧菌引起的食品污染中溶細胞毒素快速檢測試劑盒的研發(fā)奠定基礎。方法：IPTG誘導含pET28a(+)-vvhA的大腸桿菌表達rVVC，將rVVC純化
2、、復性后經(jīng)甲醛脫毒作為抗原免疫BALB/c小鼠。SDS-PAGE檢測蛋白純化后效果。采用雜交瘤技術和ELISA法制備并篩選分泌rVVC單克隆抗體的雜交瘤細胞株，有限稀釋法對陽性孔克隆化培養(yǎng)。采用免疫雙擴法鑒定單克隆抗體類型，ELISA法、免疫雙擴法鑒定單克隆抗體的特異性。結果：將純化復性后的rVVC作為抗原免疫小鼠后，經(jīng)ELISA檢測，血清有效稀釋度達1:12?800。共獲得2株可持續(xù)分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別為B2C7和E3F4株，其抗體類型均為IgG1，且具有較高特異性，與多種其他細
3、菌蛋白不發(fā)生免疫反應。結論：本研究成功免疫BALB/c小鼠，獲得B2C7和E3F4兩株可持續(xù)穩(wěn)定分泌rVVC鼠源性單克隆抗體的雜交瘤細胞株，抗體類型為IgG1型?！娟P鍵詞】創(chuàng)傷弧菌;溶細胞素;vvhA基因;雜交瘤;單克隆抗體 Abstract:?Objective:Mouse-originalmonoclonalantibodyagainstrebinantVibriovulnificuscytolysin(rVVC)munoglobulinentofrapiddetectionkitofVi
4、briovulnificuscytolysin.Methods:?IPTGmuneBALB/c.TheeffectsofexpressionandpurificationofrVVCinedbySDS-PAGE.Thehybridomacelllinestosecreteanti-rVVCmonoclonalantibodiesatechniqueandELISA，andtheniteddilution.Doubleimmunodiffusionassayonoclonalantibody.EL
5、ISAanddoubleimmunodiffusionassayinethespecificity.Results:?ThemiceimmunizedbyrVVCdilutionto1:12?800byELISA.Taonoclonalantibodies.Themonoclonalantibodiesshootherbacteria.Conclusion:?BALB/cmiceissuccessfullyimmunizedandtouse-originhybridomacelllinesnam
6、edB2C7andE3F4onoclonalantibodiesagainstrVVCareacquired.ThetypeofmonoclonalantibodyagainstrVVCisIgG1. Keya;monoclonalantibody 創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus，Vv)是一種有莢膜的革蘭陰性嗜鹽弧菌，主要存在于海水及海產(chǎn)品中，可引起原發(fā)性敗血癥和嚴重的創(chuàng)口感染[1-2]。近幾年，浙江沿海、深圳也時有報道該菌感染病例，已引起很多專家學者關注。創(chuàng)傷弧菌可能包含諸多毒
7、力因子[3]，溶細胞素是其唯一分泌至胞外具有種特異性的膜成孔類外毒素[4]，可作用于多種靶細胞誘導細胞凋亡、壞死，引起細胞炎癥反應等[5-6]。此外，體外重組的創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(rebinantVibriovulnificuscytolysin，rVVC)亦具有典型的細胞毒活性，能引起人ECV304細胞凋亡[7]，誘導人SMMC7721細胞產(chǎn)生細胞應激，上調(diào)其TNF-α和HSP90的表達[8]。目前，有關創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(Vibriovulnificuscytolysin，VVC)抗體的研究較少
8、，姚蔚等[9]曾利用體外rVVC制備了其多克隆抗體，并證實該多抗能阻斷rVVC對SMMC7721的細胞毒作用，為保護性抗體。而單克隆抗體相比多克隆抗體，具有更高的特異性。因此，本研究中，我們采用Ni2+-NTA親和層析法純化原核表達的rVVC，采用雜交瘤技術制備鼠源性rVVC單克隆抗體并進行免疫學鑒定，以期為VVC致病機制的深入研究及創(chuàng)傷弧菌引起的食品污染中溶細胞毒素的快速檢測試劑盒研發(fā)奠定基礎?！ ???材料和方法 1.1??材料 1.1.1??細胞系、菌種及質(zhì)粒：小鼠骨髓瘤SP2/0細胞
