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1、BMSCs條件培養(yǎng)基對神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化的影響 神經(jīng)干細(xì)胞（neuralstemcells,NSCs）是一類分布于神經(jīng)系統(tǒng)，具有自我更新并擁有多向分化潛能的干細(xì)胞，其主要分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞，替代受損的神經(jīng)組織從而起到治療脊髓損傷的作用[1-2].骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarroesenchymalstemcells,BMSCs）屬于成體干細(xì)胞的一種，不僅具有成骨、成脂等多向分化潛能，還能分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子[3],近年來利用BMSCs與NSCs共培養(yǎng)技術(shù)治療脊髓損傷已成為研究熱點。有報道[4]指出，BMSCs與NSCs共移植治療神經(jīng)損傷
2、療效優(yōu)于單純移植NSCs,說明BMSCs為NSCs的生長與分化提供了一個更加合適的微環(huán)境?！ ∪欢?，是BMSCs本身還是其分泌的營養(yǎng)因子發(fā)揮了作用仍值得探討。該研究利用富含營養(yǎng)因子的BMSCs條件培養(yǎng)基體外培養(yǎng)NSCs,去除BMSCs本身的影響，能夠充分了解BMSCs條件培養(yǎng)基對NSCs增殖與分化的影響，為BMSCs條件培養(yǎng)基的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 1材料與方法 1.1材料 1.1.1實驗動物新生24h內(nèi)SD大鼠1只，雌雄不限；4~5周齡SD大鼠1只，100~120g,購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心?！ ?.1.2實驗試劑及儀器DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Gibco公
3、司）；DMEM低糖、南美胎牛血清（美國HyClone公司）;B-27（美國Invitrogen公司）；表皮生長因子（epidermalgroicrotubule-associatedprotein-2,MAP-2）（美國SantaCruz公司）；小鼠抗大鼠髓鞘堿性蛋白（myelinbasicprotein,MBP）（英國Abcam公司）；FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG、TritonX-100（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；CD29-PE、CD90-PE、CD34-FITC、CD44-FITC（美國BioLegend公司）；多聚賴氨酸（美
4、國Sigma公司）；MTT試劑盒、胰酶、免疫熒光稀釋液、多聚甲醛、Hoechst33342、青鏈霉素（100）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；山羊血清（中國武漢博士德公司）；ECL顯示試劑盒（美國Pierce公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國SHELLAB）；倒置顯微鏡CKX41（日本Olympus公司）；流式細(xì)胞儀（美國BDFACSVerseTM）；熒光顯微鏡DMI6000型（德國Leica公司）?！ ?.2方法 1.2.1大鼠BMSCs體外分離、培養(yǎng)、鑒定采用本課題組前期的實驗方法[5]從大鼠骨髓中分離并培養(yǎng)出BMSCs,取生長良好的第3代BMSCs,胰酶消化后制成單
5、細(xì)胞懸液，計數(shù)，參照之前的方法，行細(xì)胞表面標(biāo)記CD90、CD34、CD29的流式細(xì)胞儀檢測?！ ?.2.2大鼠BMSCs條件培養(yǎng)基的制備取第3代生長良好的BMSCs,待細(xì)胞長至約90%密度時，棄去原培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，每次5min;加入DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集濃縮上清液，按前期實驗比例配制成NSCs增殖與分化條件培養(yǎng)基。 1.2.3大鼠NSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定取新生24hSD大鼠幼鼠，處死后置于75%酒精浸泡5min;在無菌條件下分離出大腦半球，剪碎，加入0.25%胰酶消化10min,輕輕吹打混勻后經(jīng)篩X過濾成單細(xì)胞懸液；加入增殖培養(yǎng)基（DM
6、EM/F12+2%B27+20ng/mlbFGF+20ng/mlEGF+鏈霉素0.1mg/ml+青霉素100U/ml），600r/min離心5min2次，棄上清液；吹打混勻后以3105/ml接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3d半定量換液1次，培養(yǎng)7d后傳代?！ ∪〉?代培養(yǎng)7d的細(xì)胞球，600r/min離心5min,棄上清液，接種于經(jīng)0.1mg/ml多聚賴氨酸包被蓋玻片的6孔板中，置于37℃培養(yǎng)箱6h,使懸浮干細(xì)胞貼壁。用PBS洗滌3次，每次5min;4%多聚甲醛固定后，PBS洗滌3次，每次5min.在含0.3%TritonX-100中孵育10mi
7、n,PBS洗3次后，加入正常山羊血清封閉液，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h后，加入1∶50稀釋Nestin一抗，4℃條件下孵育過夜。次日常溫下放置2h,PBS洗滌3次，每次5min,加入1100稀釋FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育1h.最后行Hoechst溶液核染后封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照?！ ?.2.4大鼠NSCs分化及分化后鑒定取第2代培養(yǎng)7d的NSCs球，600r/min離心5min,棄上清液；加入分化培養(yǎng)基（DMEM/F12+2%B27+鏈霉素0.1mg/ml+青霉素100U/ml+10%FBS），吹
