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1、荔枝核總皂苷體外抗乙型肝炎病毒的作用蔣蔚峰，陳建宗，張娟，張金平，賈新【摘要】目的：觀察荔枝核總皂苷體外抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用.方法：以HepG2.2.15細(xì)胞為靶細(xì)胞，分別用不同濃度的荔枝核總皂苷和拉米夫定培養(yǎng)液培養(yǎng)，采用ELISA法及熒光定量PCR法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清HBsAg,HBeAg及細(xì)胞外HBVDNA含量，評(píng)價(jià)荔枝核總皂苷對(duì)體外HBV的抑制作用.結(jié)果：荔枝核總皂苷對(duì)體外培養(yǎng)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg,HBeAg及細(xì)胞外HBVDNA的50％抑制濃度(IC50)分別為0.096，0.085和0.128g/L，治療指數(shù)(TI)分別為6.
2、98，7.88和5.23.0.25g/L拉米夫定組和0.4g/L荔枝核總皂苷組在d3，d6對(duì)體外培養(yǎng)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg，HBeAg及細(xì)胞外HBVDNA的抑制作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）.結(jié)論：荔枝核總皂苷具有一定的體外抗HBV作用.【關(guān)鍵詞】荔枝核；皂苷類；HepG2.2.15細(xì)胞；肝炎病毒，乙型0引言 我國屬乙型病毒性肝炎高流行區(qū)，2004年中國疾病預(yù)防控制中心調(diào)查顯示我國HBsAg感染率高達(dá)9.09％［1］.目前，尚沒有理想的治療慢性乙型肝炎的藥物.我國有數(shù)千年應(yīng)用中草藥治療疾病的傳統(tǒng)和經(jīng)驗(yàn)，從中已發(fā)現(xiàn)了不少抗乙型肝炎病毒(H
3、BV)的藥物.荔枝核是無患子科植物荔枝（LitchichinensisSonn）的成熟種子，又名荔仁或荔核，味甘、微苦，歸肝、腎經(jīng)，具有行氣散結(jié)、祛寒止痛的功效.其化學(xué)成分包括皂苷、蒜質(zhì)和脂肪酸等多種物質(zhì).研究發(fā)現(xiàn)，荔枝核黃酮類提取物對(duì)乙肝病毒HBsAg，HBeAg以及HBVDNA有明顯的抑制作用［2-3］.但荔枝核皂苷是否具有抑制HBV的作用，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道.我們采用HepG2.2.15細(xì)胞為靶細(xì)胞，觀察不同濃度荔枝核總皂苷體外對(duì)HBV的抑制作用.1材料和方法1.1材料HepG2.2.15細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院全軍感染病診療中心王平忠博士惠贈(zèng)；噻唑藍(lán)(
4、MTT)，二甲基亞砜(DMSO)和G418(Sigma公司)；HBsAg和HBeAg的ELESA檢測(cè)試劑盒(華美生物公司)；Model1680酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(德國Bio?Rad公司)；HBVDNA提取及擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒(廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)液、胰蛋白酶、EDTA、L?谷氨酰胺、胎牛血清(Gibco公司)；PE7700型自動(dòng)熒光PCR檢測(cè)儀(美國PerkinElmer公司).荔枝核總皂苷由第四軍醫(yī)大學(xué)藥劑科提取，實(shí)驗(yàn)時(shí)用DMSO溶解后再以含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋，分別配制成0.4，0.2，0.1，0.05，0.
5、025g/L共5個(gè)濃度梯度，含藥培養(yǎng)液中DMSO濃度不超過10g/L.拉米夫定由葛蘭素史克制藥有限公司提供，實(shí)驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)液稀釋成0.25g/L.1.2方法HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)液(含100mL/L胎牛血清，400mg/LG418及0.3g/L谷氨酰胺，56g/L碳酸氫鈉調(diào)pH值至7.2)中，培養(yǎng)于37℃，飽和濕度，50mL/LCO2，每72h更換培養(yǎng)液1次.細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底約80%，用2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/LEDTA1∶1混合消化3～5min，1∶3分瓶傳代.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/L，接種于96孔板
6、，每孔0.2mL，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn).荔枝核總皂苷按配制不同濃度分組，同時(shí)設(shè)僅加細(xì)胞培養(yǎng)液的陰性對(duì)照組和含0.25g/L拉米夫定的陽性對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔.d3更換同樣濃度含藥培養(yǎng)液及對(duì)照培養(yǎng)液1次.各孔用藥d3，d6將吸取的上清液置于-20℃冰箱保存待檢.另分別收集貼壁后1～6d的細(xì)胞培養(yǎng)上清，-20℃保存，統(tǒng)一檢測(cè).使用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清的HBsAg和HBeAg，顯色反應(yīng)后，酶標(biāo)儀讀取A450nm值，繪制分泌曲線.1.2.1藥物對(duì)細(xì)胞毒性試驗(yàn)荔枝核總皂苷配制成0.8，0.4，0.2，0.1，0.05，0.025，0.0125，0.
7、00625g/L共8個(gè)濃度梯度，HepG2.2.15細(xì)胞以1×107個(gè)/L接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁后各藥物組換入相應(yīng)含藥培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組換入正常培養(yǎng)液.于加藥d6吸去上清液，每孔加5g/LMTT20μL，37℃孵育4h，棄上清液后每孔加入DMSO150μL，震蕩10min，測(cè)A490nm值.計(jì)算細(xì)胞存活率(％)=(實(shí)驗(yàn)組A490nm值/陰性對(duì)照孔A490nm值)×100％；半數(shù)中毒濃度(TC50)=Antilog［logB+(50-B)的抑制百分率/(A-B)的抑制百分率×C］，(A≥抑制50％藥物濃度，B≤抑制50％藥物濃度，C=log稀釋倍數(shù)).1.2
8、.2上清液HBsAg和H
