纈沙坦對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻模型大鼠腎間質(zhì)纖維化作用論文

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1、纈沙坦對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻模型大鼠腎間質(zhì)纖維化作用論文王凱孫建平劉麗秋馬瑞霞李玉山周立冬【摘要】目的研究血管緊張素Ⅱ型受體拮抗劑纈沙坦對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型大鼠腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程的作用。方法健康ethodsAUUOmodelin)的合成與降解失衡，導(dǎo)致ECM在腎間質(zhì)的廣泛沉積是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生的本質(zhì)2。腎間質(zhì)纖維化的促進(jìn)因素涉及范圍較廣,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)是目前公認(rèn)的強(qiáng)致纖維化因子4。骨橋蛋白(OPN)存在于多種生物中，可以多種不同的成熟形式存在于不同的組織細(xì)胞及正常體液中，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，可以

2、引起大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而炎性細(xì)胞可產(chǎn)生TGFβ1，參與間質(zhì)成纖維細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞ECM的過(guò)量合成,最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)選用TGFβ1、OPN作為觀察指標(biāo)，探討纈沙坦抗腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料與方法1.1動(dòng)物模型的建立與分組50只雄性ARK公司生產(chǎn)全自動(dòng)生化儀(型號(hào)AGⅡ)分別測(cè)定血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平。1.2.2腎臟組織病理學(xué)觀察石蠟包埋組織切片，片厚2μm，行常規(guī)蘇木精伊紅染色，在200倍光鏡下觀察腎小管間質(zhì)病變情況。1.2.3OPN檢測(cè)采用E

3、liVision法，抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自福州邁新生物工程有限公司，切片厚度2μm，一抗為兔抗大鼠多克隆抗體(1∶100)，二抗為羊抗兔IgG(1∶100),DAB顯色，并以0.01mmol/LPBS緩沖液作為空白對(duì)照。采用ImageProPlus病理圖像分析軟件，每張切片隨機(jī)采集10個(gè)視野，檢測(cè)陽(yáng)性目標(biāo)累積吸光度、空白區(qū)域面積，計(jì)算切片平均吸光度，用其反映OPN的表達(dá)強(qiáng)度。1.2.4TGFβ1mRNA表達(dá)檢測(cè)采用RTPCR方法，以SimplyP總RNA提取試劑盒(杭州博日生

4、物科技有限公司)提取總RNA,嚴(yán)格按照其說(shuō)明書(shū)操作。在核酸蛋白測(cè)定儀(德國(guó)Eppendorf)上測(cè)定總RNA的吸光度(A)值并計(jì)算其濃度。RT及PCR操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(日本TAKARA公司)。TGFβ1引物：正義鏈5′GCCTGAGTGGCTGTCTTTTGA3′,反義鏈5′GGAAGGGTCGGTTCATGTCAT3′,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為197bp。GAPDH引物：正義鏈5′GCAAAGTGGAGATTGTTGCCAT3′,反義鏈5′CCTTGACTGTGCCGTTGAATTT3

5、′,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為108bp。TGFβ1的擴(kuò)增條件為：94℃2min，94℃30s，58℃30s，72℃1min，共32個(gè)循環(huán);GAPDH的擴(kuò)增條件為：94℃2min，94℃30s，58℃30s，72℃1min，共30個(gè)循環(huán);最后均72℃終末延伸10min。取上述擴(kuò)增產(chǎn)物5μL在含溴化乙錠(0.5mg/L)的20g/L的瓊脂糖凝膠上電泳，紫外線透射凝膠成像儀(法國(guó)VilberLourmat公司)檢查有無(wú)特異條帶并掃描各電泳帶的灰度值，用美國(guó)BioRad公司的MolecularAnalyst軟件進(jìn)行半定量分析

6、，計(jì)算其與內(nèi)參照GAPDH吸光度比值。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理以SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料結(jié)果以±s表示，對(duì)所測(cè)結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)。均數(shù)的多組間比較采用方差分析。2結(jié)果2.1各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間生化指標(biāo)的比較與對(duì)照組比較，模型組及纈沙坦組大鼠術(shù)后第3天Scr及BUN差異無(wú)顯著性(P0.05)，第10、20天時(shí)顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.75～40.83，q=3.32～11.87,P0.05)。與模型組相比，纈沙坦組Scr及BUN術(shù)后第10、20天均較低，差異有顯著性(q=3.36～9.

7、55，P0.05、0.01)。見(jiàn)表1、2。2.2術(shù)后大鼠腎臟組織病理學(xué)的改變光鏡下觀察，術(shù)后第3天，模型組大鼠腎小管上皮細(xì)胞呈灶狀空泡和顆粒變性，腎間質(zhì)偶見(jiàn)灶狀淋巴和單核細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管上皮細(xì)胞除變性外，部分出現(xiàn)崩解脫落及再生，部分呈灶狀上皮細(xì)胞萎縮，管腔擴(kuò)張，萎縮小管周圍出現(xiàn)纖維化，伴少量淋巴和單核細(xì)胞浸潤(rùn);第20天后腎間質(zhì)纖維化及腎小管萎縮加重，呈多灶分布。腎小球始終無(wú)明顯變化。各時(shí)間點(diǎn)治療組與模型組相比，未見(jiàn)明顯形態(tài)學(xué)差異。對(duì)照組大鼠腎臟無(wú)形態(tài)學(xué)異常。2.3各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間腎組織OPN表達(dá)的比較對(duì)照組腎組織

8、中OPN主要表達(dá)于部分腎小管近曲小管、遠(yuǎn)曲小管、髓袢升支粗段及一些集合管上，腎間質(zhì)未見(jiàn)著色;與對(duì)照組相比，模型組及纈沙坦組大鼠自第3天起OPN在腎小管間質(zhì)的陽(yáng)性染色強(qiáng)度明顯升高，差異有顯著意義(F=64.36～231.51，q=14.17～30.42,P0.01);與模型組比較，纈沙坦組大鼠從第10天起在腎小管間質(zhì)的陽(yáng)性染色強(qiáng)度明顯降低，差異有