原生質(zhì)體融合技術(shù)簡介.ppt

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1、原生質(zhì)體融合一原生質(zhì)體融合二原生質(zhì)體融合的特點(diǎn)三原生質(zhì)體融合的過程四原生質(zhì)體融合的應(yīng)用一原生質(zhì)體融合定義:原生質(zhì)體融合就是將兩個親株的細(xì)胞壁分別通過酶解作用加以剝除,使其在高滲環(huán)境中釋放出只有原生質(zhì)膜包被著的球狀原生質(zhì)體。然后將兩個親株的原生質(zhì)體在高滲條件下混合,由聚乙二醇助融,使它們相互凝集,通過細(xì)胞質(zhì)融合接著發(fā)生兩次基因組之間的接觸、交換、遺傳重組,在再生細(xì)胞中獲得重組體。一原生質(zhì)體融合原理:兩個具有不同基因型的細(xì)胞,采用適宜的水解酶剝離細(xì)胞壁后,在融合劑作用下,兩原生質(zhì)體接觸,融合成為異核體,經(jīng)過繁殖復(fù)制進(jìn)一步核融合,形成雜合二倍體,再經(jīng)過染色體交換產(chǎn)生重

2、組體,達(dá)到基因重組的目的,最后對重組體進(jìn)行生產(chǎn)性能,生理生化和遺傳特性分析。二原生質(zhì)體融合的特點(diǎn)1雜交頻率較高由于原生質(zhì)體沒有細(xì)胞壁的障礙,而且在原生質(zhì)體融合時加入融合促進(jìn)劑PEG,所以微生物原生質(zhì)體間的雜交頻率都明顯高于常規(guī)雜交方法。2受接合型或致育性的限制較小由于兩親株中任何一株都可能起受體或供體的作用,因此有利不同種屬間微生物的雜交。另外,出于原生質(zhì)體融合是和致育性沒有關(guān)系的細(xì)胞雜交,所以其受接合型或致育性的限制就比較小。3重組體種類較多由于原生質(zhì)體融合后,兩個親株的整套基因組之間發(fā)生相互接觸.有機(jī)會發(fā)生多次交換,可以產(chǎn)生各種各樣的基因組合而得到多種類型的

3、重組體4遺傳物質(zhì)的傳遞更為完整由于原生質(zhì)體融合是兩個親株的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核進(jìn)行類似合二為一的過程,因此,遺傳物質(zhì)的交換更為完整。原核微生物中可以得到將兩個或更多個完整的基因組攜帶到—起。5可以獲得性狀優(yōu)良的重組體可以與其他的育種方法相結(jié)合,將從其他方法獲得的優(yōu)良性狀,通過原生質(zhì)體融合再組合到一個單菌株中。6可以提高育種(篩選)效率采用溫度、藥物或紫外線照射等處理鈍化一方親株的原生質(zhì)體,然后再與另一親株的原生質(zhì)體融合,因此就可以在篩選過程中除去一方親株,從而提高篩選效率。7有可能采用產(chǎn)量性狀較高的茵株作為融合親株由于遺傳標(biāo)記如營養(yǎng)缺陷型往往影響工業(yè)微生物的某些生物合

4、成能力,而進(jìn)行一般基因重組時又必須采用較多的遺傳標(biāo)記,因此,勢必使出發(fā)菌株的生產(chǎn)性能下降而影響雜交子代的生產(chǎn)水平。但由于原生質(zhì)體融合頻率較高.所以采用較少標(biāo)記或不帶標(biāo)記的菌株進(jìn)行融合.這對改良生產(chǎn)菌株性能來說非常有效。8有助于建立工業(yè)微生物的轉(zhuǎn)化體系三原生質(zhì)體融合的過程親株甲乙原生質(zhì)體融合體酶解融合再生再生篩選優(yōu)化遺傳標(biāo)記親株篩選原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體再生及再生頻率計算原生質(zhì)體的融合異核體檢出重組體檢出和鑒定重組體的形態(tài),生理生化和遺傳分析1標(biāo)記菌株的篩選用于原生質(zhì)體融合的親本需要攜帶遺傳標(biāo)記,以便于重組體的檢出。常用營養(yǎng)缺陷型和抗性作為標(biāo)記,也可以采用熱致死,孢

5、子顏色,菌落形態(tài)作為標(biāo)記。實際時究竟采用哪種遺傳標(biāo)記,要根據(jù)實驗?zāi)康膩泶_定。如果原生質(zhì)體融合的目的是為了進(jìn)行遺傳分析,那么應(yīng)該采用帶有隱性基因的營養(yǎng)缺陷性或抗性菌株;如果從育種角度進(jìn)行原生質(zhì)體融合,由于大多數(shù)營養(yǎng)缺陷性菌株都會影響代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量,所以在選擇營養(yǎng)缺陷性標(biāo)記時,應(yīng)盡量避免采用對正常代謝有影響的缺陷性菌株2原生質(zhì)體的制備獲得有活力、去壁較為完全的原生質(zhì)體是原生質(zhì)體融合育種技術(shù)的先決條件。在細(xì)菌和放線菌中,制備原生質(zhì)體主要采用溶菌酶;制備葡萄球菌的原生質(zhì)體,則需用溶葡萄球菌素處理;制備酵母菌的原生質(zhì)體時,一般可用蝸牛酶;制備絲狀真菌的原生質(zhì)體時,可用蝸牛

6、酶,在絲狀真菌的原生質(zhì)體制備中很少單獨(dú)使用一種酶,而是采用兩種或三種酶混合處理。另外,影響原生質(zhì)體制備的因素有許多,主要是菌體的性質(zhì),酶的性質(zhì)以及反應(yīng)環(huán)境(1)菌體的前處理為了使酶的作用效果更好一些,可對菌體作一些前處理,主要是在培養(yǎng)基中加入一些物質(zhì),加入這些物質(zhì)的目的,就是使菌體的細(xì)胞壁對酶的敏感性增加。例如:青霉素能干擾甘氨酸交聯(lián)橋與四肽側(cè)鏈上的D—丙氨酸之間的聯(lián)結(jié),使細(xì)菌不能合成完整的具有空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的細(xì)壁,結(jié)果使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松,便于溶菌酶處理。(2)菌體的培養(yǎng)時間微生物能否較好地形成原生質(zhì)體與微生物的生理狀態(tài)有一定的關(guān)系。為了使菌體細(xì)胞易于原生質(zhì)體比,一

7、般選擇對數(shù)生長期的菌體。這時的細(xì)胞正在生長,代謝旺盛,細(xì)胞壁對酶解作用最為敏感。由其得到的原生質(zhì)體,形成率高,再生率也很高。(1)酶濃度對于不同種屬的微生物來說.不僅對酶的種類要求不同,就是酶的濃度也有差異。一般地說,酶濃度增加,原生質(zhì)體的形成率也增加,超過一定范圍.則原生質(zhì)體形成率的提高不明顯。酶濃度過低,則不利于原生質(zhì)體的形成;酶濃度過高,則導(dǎo)致原生質(zhì)體再生率的降低。因此,有人建議以使原生質(zhì)體形成率和再生率之積達(dá)到最大時的酶濃度作為最佳酶濃度。(2)酶解溫度據(jù)報道酶解溫度對原生質(zhì)體再生的影響很大。因此,在選擇最佳酶解溫度時.除了要考慮酶的最適溫度外,還要用原

8、生質(zhì)體再生率加以校正(3

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