農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化

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1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的將目的基因?qū)胨镜姆椒?。?shí)驗(yàn)原理隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的參與植物抗病有關(guān)的基因被分離出來，如防衛(wèi)反應(yīng)有關(guān)的基因、參與抗病信號(hào)傳導(dǎo)的基因，參與對(duì)病原物識(shí)別的基因等，要鑒定這些基因在植物抗病性中的作用和地位，就要構(gòu)建轉(zhuǎn)化植物的雙元載體如超量表達(dá)、反義和RNA干涉的雙元載體轉(zhuǎn)化植物，來明確該基因在植物抗病中的作用。水稻上常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法分為DNA直接導(dǎo)入法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法。DNA直接導(dǎo)入法主要包括PEG（polyethyleneglycol）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法、電擊轉(zhuǎn)化法、基因槍轉(zhuǎn)化法和花粉管通道轉(zhuǎn)化法。其中PEG法、電

2、穿孔法以原生質(zhì)體為受體，由于對(duì)原生質(zhì)體再生的依賴而在應(yīng)用上受到很大限制。基因槍法優(yōu)點(diǎn)是受體廣泛，不受寄主范圍的限制，轉(zhuǎn)化率較高，但和其它DNA直接導(dǎo)入法一樣存在共同的缺點(diǎn)：外源DNA的整合方式復(fù)雜，常常是多拷貝插入，較易出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象，轉(zhuǎn)化的外源基因片斷不能太大（上限是16-20kb），轉(zhuǎn)入基因的分離有時(shí)呈非孟德爾遺傳等。同DNA直接導(dǎo)入法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法不需要原生質(zhì)體的培養(yǎng)，簡(jiǎn)便易行，能有效地轉(zhuǎn)入較大的外源DNA片斷；轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化的外源基因整合位點(diǎn)比較穩(wěn)定（一般在T-DNA25bp處與植物基因組整合），整合的外源基因基本上保持其結(jié)構(gòu)的完整性；整合的外

3、源基因多為單拷貝或低拷貝；整合的外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中的顯性表達(dá)率較高，共抑制現(xiàn)象相對(duì)較少；轉(zhuǎn)入的外源基因通常以孟德爾遺傳規(guī)律遺傳。所以已成為轉(zhuǎn)化單子葉植物的首選方法。一、目標(biāo)基因?qū)r(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化1.1農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備1.取-70℃保存的農(nóng)桿菌EHA105于含50μg/ml利福平Y(jié)M平板劃線，28℃黑暗培養(yǎng)。2.挑取單菌落接種于5mlYM液體培養(yǎng)基中，220rpm28℃振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)。3.取2ml菌液轉(zhuǎn)接于100mlYM液體培養(yǎng)基中，28℃，220rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5。4.轉(zhuǎn)入無菌離心管，5000rpm離心5分鐘,去上清液。5.加入10ml預(yù)

4、冷的0.1M的CaCl2溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置20分鐘后，4℃，5000rpm離心5分鐘，去上清。6.加入4ml預(yù)冷的含10%甘油的0.1M的CaCl2溶液，輕輕懸浮。7.農(nóng)桿菌懸浮液分裝于無菌Eppendorf管中，每管200μl凍存于-70℃。1.2.雙元載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105取1μg左右的質(zhì)粒DNA加入到200mlEHA105感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后，冰浴30分鐘，-70℃放置3分鐘，42℃水浴1-2分鐘，加入800mlYM液體培養(yǎng)基28℃，175rpm搖培2-3小時(shí)后涂在含50μg/mlKanamycin的YM平板上，28℃培養(yǎng)。1.3農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的PC

5、R鑒定將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子，用PCR方法鑒定是否正確轉(zhuǎn)進(jìn)EHA105中。挑取轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌單菌落接種于含50μg/mlKanamycin的YM液體培養(yǎng)基中，28℃，220rpm搖培16小時(shí)，直接用菌液做PCR。PCR所用的引物為pCAMBIA1301載體上特異性的引物FP35S：5’-TACGCACAATCCCACTATCCTT-3’，RPGUS：5’-CTGATGCTCCATCACTTCCTGA-3’。PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：94℃預(yù)變性3分鐘后開始以下循環(huán)反應(yīng)：94℃變性30秒，50℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，35個(gè)循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸10分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，取20μl反應(yīng)

6、液在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR反應(yīng)體系母液濃度體積終濃度農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子菌液體2μlP12μM2μl200nMP22μM2μl200nM10×PCRBuffer2μlMg2+25mM1.2μl1.5mMdNTP2.5mM1.2μl150μMTaq酶5U/μl0.2μl1UH2O9.4μl終體積20μl2.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化2.1.水稻轉(zhuǎn)化受體的準(zhǔn)備2.1.1.水稻幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)取開花后12-15天左右的水稻幼穗脫粒,用清水漂去秕粒,用70%乙醇浸泡1-2分鐘，然后用加有幾滴Tween20的1.25%的次氯酸鈉溶液（活性氯含量為1.25%）浸泡9

7、0分鐘進(jìn)行表面滅菌，滅菌時(shí)要經(jīng)常攪拌。用無菌水沖洗3-4次，瀝去水備用。在無菌濾紙上用鑷子和刮牙器擠出水稻幼胚置于固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基（NB培養(yǎng)基）上，26℃暗培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織。約5-7天后剝下愈傷組織，轉(zhuǎn)入新鮮配制的繼代培養(yǎng)基（NB培養(yǎng)基）上，在相同條件下繼代培養(yǎng)5天左右，用于共培養(yǎng)。2.1.2.水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)去殼的水稻成熟種子先用70%乙醇浸泡1-2分鐘，然后用0.1%升汞浸泡30分鐘，進(jìn)行表面滅菌(最好在搖床上進(jìn)行)，無菌水沖洗3-4次，再將種子放在無菌濾紙上吸干水分后，放在成熟胚愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，26℃暗培養(yǎng)。約10-15天后，剝下成