農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化畢業(yè)論文

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1、摘要水稻是世界上最重要的糧食作物之一，為約40%的人口提供了主要食糧。蟲(chóng)害是造成水稻減產(chǎn)減收的主要原因之一。水稻蟲(chóng)害種類繁多，我國(guó)每年因蟲(chóng)害造成的產(chǎn)量損失占到水稻總產(chǎn)量的5%以上，給水稻的生產(chǎn)帶來(lái)了極大危害。目前，我國(guó)控制水稻蟲(chóng)害最主要的方法是使用化學(xué)殺蟲(chóng)劑，但化學(xué)防治帶來(lái)一系列問(wèn)題，如環(huán)境污染，生產(chǎn)成本提高和食用安全性降低等。因此，通過(guò)培育自身能夠抵抗蟲(chóng)害的水稻品種來(lái)防治水稻蟲(chóng)害無(wú)疑是最經(jīng)濟(jì)安全的有效策略。從已有的研究來(lái)看，僅依靠常規(guī)育種難以解決抗蟲(chóng)種質(zhì)資源稀缺的問(wèn)題，因此，通過(guò)基因工程手段導(dǎo)入外源抗蟲(chóng)基因，進(jìn)而培育抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻越來(lái)越受到人們的重視。近年來(lái)轉(zhuǎn)Bt

2、基因抗蟲(chóng)水稻已經(jīng)在生產(chǎn)上得到了廣泛的應(yīng)用，隨著抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻的大規(guī)模種植，Bt基因抗蟲(chóng)譜相對(duì)狹窄及害蟲(chóng)易產(chǎn)生耐受性等問(wèn)題相繼引起了人們的關(guān)注。因此，從自然界中分離克隆出更多、更有效的基因成為解決這些問(wèn)題的方法之一。秈稻是亞洲栽培稻的重要亞種，全世界水稻栽培品種中有80%以上屬于秈稻，其組織培養(yǎng)研究具有重要意義。而秈稻的組培特性普遍較差，再生率很低，導(dǎo)致一些生產(chǎn)上應(yīng)用價(jià)值較大的優(yōu)良品種轉(zhuǎn)化仍然難以成功或轉(zhuǎn)化頻率低，因而研究?jī)?yōu)質(zhì)秈稻的愈傷組織形成和植株再生能力對(duì)于遺傳轉(zhuǎn)化率提高十分必要。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法因具有轉(zhuǎn)化拷貝數(shù)低等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，而廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻研究中。然而，

3、水稻不同品種間遺傳差異性比較大，且轉(zhuǎn)化反應(yīng)對(duì)水稻基因型依賴性強(qiáng)，從而增加了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化的復(fù)雜性和隨機(jī)性。因此，通過(guò)對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化提高轉(zhuǎn)化率十分必要。本研究主要進(jìn)行了以下方面的工作：1.在新型Bt基因Cry30Fa1和Cry54Aa1序列的兩端分別增加酶切位點(diǎn)序列，送基因合成公司合成，然后將目的基因片段與中間克隆載體pUPROK分別進(jìn)行雙酶切，連接，獲得含目的基因的中間載體。測(cè)序鑒定得到序列正確的陽(yáng)性載體，用內(nèi)切酶切下目的基因片段并插pCDMAR-Hyg載體，最終獲得高效表達(dá)雙元載體pCDMAR-Cry30Fa1-Hyg與pCDMAR-C

4、ry54Aa1-Hyg，并通過(guò)酶切和測(cè)序的方法鑒定出上述載體的正確性。1.通過(guò)對(duì)愈傷組織繼代次數(shù)與繼代培養(yǎng)基中加入抗壞血酸（Vc）濃度的優(yōu)化，調(diào)整愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)，提高胚性愈傷組織數(shù)量。結(jié)果表明R125與R818的愈傷組織繼代2-3次，分化率最高；繼代培養(yǎng)基中加入Vc濃度為40mg/L，能減少愈傷組織褐化率且對(duì)其分化能力無(wú)影響。2.通過(guò)對(duì)洗菌后及分化前愈傷組織的干燥處理，改良農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明洗菌后進(jìn)行干燥及分化前愈傷組織在濾紙上干燥2天，能夠加快分化速度，提高分化率。3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因Cry30Fa1與Cry54Aa1轉(zhuǎn)入三系恢復(fù)系R1

5、25與R818中，通過(guò)PCR檢測(cè)與潮霉素溶液檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果表明Cry30Fa1與Cry54Aa1轉(zhuǎn)R125未獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株；Cry54Aa1轉(zhuǎn)R818也未獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株；Cry30Fa1轉(zhuǎn)R818共獲得233株轉(zhuǎn)基因再生植株，經(jīng)過(guò)潮霉素溶液檢測(cè)和分子檢測(cè)，其中46株為含目的基因的陽(yáng)性植株。關(guān)鍵詞：秈稻；Cry30Fa1基因；Cry54Aa1基因；抗蟲(chóng)；農(nóng)桿菌介導(dǎo)法AbstractRiceisoneofthemostimportantgraincropsintheworld,forabout40%oftheworld'spopulationtakingi

6、tastheirstaplefood.However，insectdamageisoneofthemainreasonstodecreasethericeyield.TherearealargevarietyofricepestsinChina.Thericeproductionlossismorethan5%oftotalyieldbecauseofinsectdamage.Atpresent,themainmethodtocontrolricepestistoutilizechemicalpesticides.However,itcausedalotofprob

7、lems,suchasenvironmentalpollution,higherproductioncost,foodsafety,etc.Breedingnewricevarietiesthatproduceinsecticidalproteinsbythemselvesisundoubtedlythemosteconomicalandsecuritystrategy.Onthebasisofpreviousreports,itisdifficulttosolvetheproblembytraditionalbreedingbecauseofricegermp