農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化原理

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1、農(nóng)桿菌介導的植物遺傳轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的分類革蘭氏陰性菌、桿狀；按侵染植物的后果分為：?根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）形成冠癭（crowngall）?發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacteriumrhizogenes）形成發(fā)根（hairyroot）按合成/代謝冠癭堿（Opine）的種類，根癌農(nóng)桿菌分為：?章魚堿（Octopine）型?胭脂堿（Nopaline）型?農(nóng)桿堿（Agropine）型冠癭堿：農(nóng)桿菌的碳源及氮源，其他物種不能代謝利用，使農(nóng)桿菌擁有了獨特的生態(tài)位。未侵染時棲息于土壤表層，侵染植物導致冠癭?。ǜ┎。?；侵染植物受傷部位（嫁接、修剪或其他

2、外力傷害等）；冠癭瘤一般位于主根與莖的結(jié)合部（樹干基部，即冠、Crown），但側(cè)根、莖、枝上也有發(fā)病。ThePlantCell,Vol.18,3350–3352冠癭病的害處：苗木感病后發(fā)育受阻；生長緩慢；植株矮小；嚴重時葉片萎蔫、早衰，甚至死亡；大樹受害后樹勢衰弱，生長不良，提前落葉，果實變小，樹齡縮短。主干受害降低材質(zhì)及工藝價值。農(nóng)桿菌能夠?qū)е轮参锂a(chǎn)生冠癭病的原因：Ti（Ri）質(zhì)粒?根癌農(nóng)桿菌含有Ti質(zhì)粒Ti：tumor-inducing?發(fā)根農(nóng)桿菌含有Ri質(zhì)粒Ri：rhizogenic?天然農(nóng)桿菌都含有Ti（或者Ri）質(zhì)粒天然Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)200～800KbT-DN

3、A區(qū)（TransferredDNA）：農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中向植物中轉(zhuǎn)移并整合進植物基因組中的部分；含有冠癭堿合成基因、生長素合成基因、細胞分裂素合成基因等；真核啟動子；?T-DNA區(qū)大?。?0～30Kb?有的Ti質(zhì)粒只含有一個T-DNA區(qū)，有的則含有多個；T-DNA區(qū)的左右邊界序列高度保守，為25bp的正向重復序列；http://www2.haut.edu.cn/d/d/gene/Chapt17/BIO7.asp毒性蛋白區(qū)（Vir區(qū)，Virulence）：包括A、B、C、D、E、F、G等基因區(qū)，有的基因區(qū)含有多個基因，形成Operons；Vir區(qū)約20Kb；!冠癭堿代謝基因

4、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的過程?植物受傷部位酚類化合物的分泌?附著（chvA、chvB）?VirA/G的雙組分系統(tǒng)感受受傷信號（signaltoAtoG）Pi?其他Vir基因的表達?T-DNA鏈的切出（VirD1+VirD2；BordertoBorder）?T-complex的形成?運輸（從細菌中輸出、進入植物細胞、入核）?整合?農(nóng)桿菌的附著植物受傷后的分泌物中含有酚類物質(zhì)（包括乙酰丁香酮，acetosyringone，AS）；這些酚類物質(zhì)可以被農(nóng)桿菌感知，借助于趨化性遷移至植物受傷部位；在ChvA、ChvB（染色體毒性基因）等的幫助下，附著到受傷部位；A.tumefaciens

5、形態(tài)農(nóng)桿菌在ChvA、ChvB等蛋白幫助下附著在植物細胞表面?毒性蛋白基因的激活VirA識別植物受傷后分泌的酚類物質(zhì)信號，并自我磷酸化，進而將磷酸化信號傳給VirG；VirG磷酸化后被活化，作為轉(zhuǎn)錄因子啟動或增加各毒性蛋白的表達；http://www2.haut.edu.cn/d/d/gene/Chapt17/BIO7.asp?T-complex形成VirD2在D1的幫助下識別T-DNA25bp邊界序列，利用外切核酸酶的在第3、4堿基之間形成缺刻;VirD2的Tyr29與缺刻的5’端共價結(jié)合；隨著DNA的合成生成T-DNA單鏈，與VirD2和VirE2結(jié)合形成T-com

6、plex；http://bs.shinshu-u.ac.jp/botany/Crown_Gall.htmlT-complex:http://www.defra.gov.uk/environment/acre/uti/03.htmVirC1突變后導致毒性喪失，其作用可能是與T-DNA右邊界附近的overdrive序列結(jié)合；Overdrive序列促進T-DNA向植物的轉(zhuǎn)移；?T-complex的轉(zhuǎn)運通過細菌細胞壁上由11個VirB蛋白和VirD4組成的通道從農(nóng)桿菌向外輸出?T-complex在植物細胞內(nèi)的運輸及整合VirD2：含有NLS，并可與Importin-α以NLS依

7、賴的方式結(jié)合，引導T-complex進入細胞核，并幫助T-DNA插入植物染色體中；（Importin-αisacomponentofoneoftheproteinnucleartransportpathwaysfoundineukaryotes）VirE2：非特異DNA結(jié)合蛋白，包裹T-DNA單鏈，使DNA由隨機卷曲狀態(tài)成為與電話聽筒線相似的規(guī)則螺旋；這種形狀使T-complex容易穿過核孔；VirE2將T-DNA包裹，可避免T-DNA從細菌向植物轉(zhuǎn)移過程中被降解；VirE2可在植物細胞膜上形成通道，使T-complex進入植物細胞；Vi