畢赤酵母表達硒代重組人血清白蛋白

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1、畢赤酵母表達硒代重組人血清白蛋白第33卷第5期2006經(jīng)北京化工大學(xué)JOURNALOFBEIJINGUNIVERSITYOFCHEMICALTECHNOLOGYVo1.33.No.52006畢赤酵母表達硒代重組人血清白蛋白陳思任銳陳勁春(北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京100029)摘要:將能夠成功表達重組人血清白蛋白(rHSA)的巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)至誘導(dǎo)期后,流加亞硒酸鈉,同時設(shè)空白對照發(fā)酵液(不加入亞硒酸鈉),通過對比相同菌株在兩組培養(yǎng)基中表達的rHSA的含硒量,判斷硒能否以硒代氨基酸的形式存在于重組蛋白質(zhì)

2、中.發(fā)酵液經(jīng)熱處理,超濾,離子交換和丙酮沉淀等步驟后,進行Tricine-SDSPAGE凝膠電泳,x射線能量色散譜(EDX)和原子吸收分析.結(jié)果表明,加硒發(fā)酵液樣品中硒元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對照多23.2%,硒與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為0.0069,高于對照發(fā)酵液近35倍,初步證明無機硒可以被畢赤酵母同化,轉(zhuǎn)化為硒代氨基酸,并形成硒代重組蛋白質(zhì).關(guān)鍵詞:亞硒酸鈉;重組人血清白蛋白;畢赤酵母中圖分類號:Q939.9引言人體的營養(yǎng)元素硒具有延緩衰老,修復(fù)機體組織和抑制癌癥等作用L1J.目前,硒的補充主要通過無機硒化合物,人工合成有機

3、硒化合物以及富硒酵母來實現(xiàn).但是硒的無機化合物多具有毒性,易引起不良反應(yīng),而注射給藥途徑限制了有機硒化合物的應(yīng)用【2J.本試驗是根據(jù)加入亞硒酸鈉后酵母便可以產(chǎn)生硒代氨基酸的思路【3J,把轉(zhuǎn)基因畢赤酵母在含硒基質(zhì)中培養(yǎng),以期硒在酵母細(xì)胞內(nèi)以硒氨基酸(SeMet,SeCys)的形式參與重組蛋白質(zhì)的合成,從而得到營養(yǎng)價值高,毒性極小,利于吸收利用的硒代重組蛋白質(zhì).人血清白蛋白(HSA)有很高的藥用價值【4],硒代人血清白蛋白即可作為白蛋白補充劑又可以作為有機硒抑制癌癥,提高免疫力,增強組織修復(fù)能力,具有很大的市場潛力.硒

4、代人血清白蛋白作為單純的營養(yǎng)保健品投放市場,與現(xiàn)有的硒營養(yǎng)品相比,其成分更加明確,安全性,有機純度和營養(yǎng)價值更高.1材料和方法1.1供試菌株P(guān)ichiapastorisGS115/rHSAMut為本實驗室收稿日期:2005—11—15第一作者:女,1982年生,碩士生*通訊聯(lián)系人E?mail:jingchunchen@hotmail.tom構(gòu)建.1.2培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基YPG:酵母提取物1.0%,大豆蛋白胨2.0%,甘油2.0%;基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基BSM:硫酸鈣0.93g/L,硫酸鉀18.2g/L,七水硫酸鎂14.9g/L

5、,檸檬酸三鈉1.47g/L,微量元素2mL/L'甘油40g/L,硫酸銨10g/L,磷酸鉀緩沖液(pH6.0)0.1mol/L.微量元素主要成分:五水硫酸銅6.0g/L,碘化鉀0.08L,一水硫酸錳3.0g/L,二水鉬酸鈉0.2L,硼酸0.02g/L,硫酸鈣0.5g/L,氯化鈷0.5g/L,氯化鋅20.0g/L,七水硫酸亞鐵65.0g/L,硫酸5.0mE/L,生物素0.2g/L.試劑均為國產(chǎn)生化試劑純或分析純.1.3實驗方法1.3.1發(fā)酵將50L種子液接種于5mL的YPG培養(yǎng)基中,30℃振蕩培養(yǎng)18—22h,轉(zhuǎn)接到裝

6、有100mL基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的500mL帶擋板的搖瓶中.轉(zhuǎn)速180r/min,溫度30℃培養(yǎng),每8小時用濃氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至6.0.約48h時,取樣檢測甘油濃度,待甘油耗盡后加入甲醇開始誘導(dǎo).誘導(dǎo)期培養(yǎng)溫度為28℃,pH值調(diào)節(jié)至7.0[],每12h補加體積分?jǐn)?shù)0.5%的純甲醇和10mg/L的亞硒酸鈉.對照發(fā)酵液不添加亞硒酸鈉.誘導(dǎo)96h后停止發(fā)酵.1.3.2發(fā)酵液的濃縮和脫鹽將發(fā)酵液于7200r/min離心5min,收集上清液;上清液60℃熱處理3h使蛋白酶失活,10000r/min離心10rain得到熱處理上清液

7、;熱處理上清液用截留分子量為30k的中北京化工大學(xué)2006正空纖維超濾膜進行脫鹽濃縮并除去小分子雜蛋白.1.3.3離子交換層析經(jīng)過脫鹽的上清液流入DEAESepharoseFF陰離子交換樹脂柱,用紫外檢測儀于280nm在線檢測,收集洗脫峰.上樣條件為0.005mol/L的磷酸鈉緩沖液,pH值6.4;洗脫液為含有0.20mol/LNaC1的磷酸鈉緩沖液,pH值8.0[7..1.3.4蛋白質(zhì)的沉淀收集采用丙酮沉淀法¨8J沉淀10mL經(jīng)離子交換后的洗脫液.上清液蒸除丙酮后電泳檢測;沉淀用1.5mL去離子水重新溶解后,10

8、000r/rain離心10min得上清液進行電泳和原子吸收分析硒含量.1.4分析方法測定所取發(fā)酵液中的細(xì)胞干質(zhì)量¨9J,再除以所取發(fā)酵液體積即得細(xì)胞質(zhì)量濃度;高碘酸鈉氧化法[m]測定甘油濃度;考馬斯亮蘭染色法[¨]測定總蛋白質(zhì)量濃度;Tricine—SDS-PAGE凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量;X射線能量色散譜分析(EDX)及原子吸收光譜法測定硒含量.2結(jié)果與討