重組人白介素18在畢赤酵母中的高效分泌表達(dá)

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1、重組人白介素18在畢赤酵母中的高效分泌表達(dá)：楊莉莉,魏楓,劉虹,李慧,于津浦,任秀寶【摘要】目的:構(gòu)建人白介素18（hIL18）真核表達(dá)載體,在畢赤酵母中高效分泌表達(dá)hIL18。方法:通過PCR法擴(kuò)增得到hIL18基因,構(gòu)建其真核表達(dá)載體pPICZaC/hIL18,電轉(zhuǎn)化畢氏酵母X33,PCR、SDSPAGE、C分泌IFNγ。結(jié)論:構(gòu)建了重組hIL18的基因工程菌,并在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了高效分泌表達(dá),為進(jìn)一步研究其活性和功能奠定了基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】人白細(xì)胞介素18;畢赤酵母;表達(dá);純化白細(xì)胞介素18(IL18)/又稱IFN

2、γ誘導(dǎo)因子(IGIF),主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子［1］。人IL18前體蛋白由193個(gè)氨基酸組成,天然IL18的活化依賴于IL1轉(zhuǎn)化酶（Interleukin1conversingenzyme,ICE）的特異裂解作用,從前體IL18的N端切除36個(gè)氨基酸殘基而使之活化［2］。IL18的生物學(xué)活性與IL12相似,能促進(jìn)T細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌IFNγ、GMCSF,抑制IL4和IL10產(chǎn)生,增強(qiáng)NK及Th1細(xì)胞的細(xì)胞毒活性等;IL18的表達(dá)還與自身免疫病、腫瘤及感染有關(guān)［3,4］,IL18在抗腫瘤及抗病毒等方面

3、具有潛在的應(yīng)用前景［5,6］。目前關(guān)于IL18制備的報(bào)道主要集中在原核表達(dá)體系［2,7］,但由于原核表達(dá)體系產(chǎn)量較低,且存在復(fù)性得率低等一些問題,使得其生產(chǎn)成本較高。為了更好的研究hIL18特性,探索新的生物學(xué)活性,我們?cè)谡婧吮磉_(dá)體系畢赤酵母中表達(dá)hIL18,試圖得到大量hIL18蛋白,更好的開展hIL18體內(nèi)或體外活性研究。本研究從胎兒肝臟組織克隆了人IL18成熟肽（即從第37位氨基酸到193位氨基酸）基因,構(gòu)建了真核重組表達(dá)質(zhì)粒,利用畢赤酵母α交配因子信號(hào)肽引導(dǎo)重組hIL18（rhIL18）成熟肽的分泌表達(dá),探索了純

4、化方法,并對(duì)其活性進(jìn)行了初步研究。1材料和方法1.1材料pPICZaC質(zhì)粒和畢赤酵母菌株X33購自Invitrogen公司;E.coliDH5α購自北京鼎國生物公司;PCR引物由上海生物工程公司合成;限制性內(nèi)切酶及T4DNA連接酶購自大連寶生物公司;PhenlySepharose6FF,QSepharoseHP購于美國GE公司。淋巴細(xì)胞分離液購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所;山羊抗人IL18抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體購自SantaCruz公司。自動(dòng)玻璃發(fā)酵罐（KLF2000型）為瑞士比歐（Bioenginee

5、r）公司產(chǎn)品;蛋白純化儀（型號(hào)AKTAexplorer10）為美國GE公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1hIL18基因的克隆及載體構(gòu)建提取胎兒肝臟組織RNA,以其為模板,根據(jù)GenBank公布序列(AccessionNo.BC007007.)設(shè)計(jì)引物,上游引物為5′CCGCTCGAGAAGAGATACTTTGGCAAG3,下游引物為5′GCCGCTCTAGATTAGTCTTCGTTTTGAACAG3(XhoI和XbaI劃線所示),PCR擴(kuò)增得到含hIL18成熟肽基因片段。為了終止C端Histag的表達(dá),下游引物中XbaI的前面

6、加入終止密碼子。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用XhoI和XbaI酶切后,連于用同樣酶切的載體pPICZaC得到質(zhì)粒pPICZaC/hIL18。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,涂于含25mg/LZeocinLB平板上,酶切鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物并測(cè)序,提取鑒定正確的陽性克隆質(zhì)粒用于表達(dá)。1.2.2質(zhì)粒pPICZaC/IL18的轉(zhuǎn)化及鑒定將重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZaC/hIL18以PmeI線性化,純化回收。將15μg線性pPICZaC/hIL18電轉(zhuǎn)化至新鮮制備的酵母感受態(tài)細(xì)胞X33中,并同時(shí)轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pPICZaC和空酵母菌作對(duì)照,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于YPD平板（

7、Zeocin的濃度為100mg/L）。28℃培養(yǎng)2~3d至長出菌落。在YPD平板（Zeocin抗性）上挑取20個(gè)克隆,提取轉(zhuǎn)化的畢赤酵母菌基因組DNA,以其為模板,以上面提到的特異引物進(jìn)行PCR鑒定,并以未轉(zhuǎn)化的酵母菌基因組DNA和空質(zhì)粒pPICZaC轉(zhuǎn)化的酵母菌基因組DNA作對(duì)照,PCR鑒定質(zhì)粒pPICZaC/hIL18是否穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。1.2.3搖瓶環(huán)境rhIL18的表達(dá)經(jīng)鑒定的重組陽性克隆pPICZaC/IL18/X33接種于10mLBMGY中,28℃、250r/min空氣搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期（A600=2～6）,3000r/m

8、in離心5min,棄上清,用10mLBMMY培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞,28℃、250r/min誘導(dǎo)rhIL18表達(dá),培養(yǎng)過程中保持良好的通氣。每24h補(bǔ)加100%甲醇誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá),至甲醇終濃度為5