觀察膠原蛋白對(duì)成纖維增殖及小鼠傷口愈合的影響

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1、觀察膠原蛋白對(duì)成纖維增殖及小鼠傷口愈合的影響　　皮膚損傷創(chuàng)面治療是臨床常見(jiàn)問(wèn)題,如患者伴有免疫功能低下及糖尿病等疾病,傷口通常較難愈合,如何促進(jìn)創(chuàng)面愈合并提高愈合質(zhì)量一直是研究的熱點(diǎn)。創(chuàng)傷修復(fù)是由多種細(xì)胞、細(xì)胞因子參與、且相互作用的復(fù)雜過(guò)程,膠原蛋白作為細(xì)胞外基質(zhì)重要組成成分可促進(jìn)多種細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、分化和增殖,并可促進(jìn)生長(zhǎng)因子等細(xì)胞因子的產(chǎn)生,促進(jìn)傷口愈合。Chai等發(fā)現(xiàn),將熒光標(biāo)記的魚(yú)鱗膠原蛋白置于小鼠皮膚表面,魚(yú)鱗膠原蛋白可透過(guò)皮膚角質(zhì)層,并可活化成纖維細(xì)胞,增強(qiáng)皮膚的彈性及保濕性。Castillo-Briceo等研究發(fā)現(xiàn):膠原蛋白中的GFOGER、GLOGEN結(jié)構(gòu)

2、域可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的黏附、增殖及IL-1β基因的表達(dá)。利用膠原蛋白膠制成的敷料治療糖尿病小鼠皮膚潰瘍,治療第7天,可使傷口縮小62%。目前,天然膠原蛋白主要于畜類及禽類動(dòng)物組織,但由于瘋牛病、口蹄疫、禽流感等疾病的爆發(fā),使陸生哺乳動(dòng)物膠原蛋白的安全性普遍受到質(zhì)疑。我國(guó)水產(chǎn)品豐富,在加工魚(yú)產(chǎn)品同時(shí)產(chǎn)生大量下腳料,其中魚(yú)鱗約占總質(zhì)量5%,通常被當(dāng)作垃圾丟棄,我國(guó)每年丟棄的魚(yú)鱗約有30萬(wàn)噸。蛋白質(zhì)是魚(yú)鱗的主要成分,約占總重的70%,其中主要是膠原蛋白和魚(yú)鱗硬蛋白。本室的前期工作表明,水提法提取的魚(yú)鱗膠原蛋白可清除氧自由基,提高超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD

3、)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)含量,具有良好的生物學(xué)活性。在此基礎(chǔ)上,本研究利用水提法提取魚(yú)鱗膠原蛋白,觀察膠原蛋白對(duì)成纖維增殖及對(duì)免疫功能低下小鼠傷口愈合的影響,為魚(yú)鱗膠原蛋白開(kāi)發(fā)利用及損傷修復(fù)治療研究奠定基礎(chǔ)?！　?、材料與方法　　1.1材料　　魚(yú)鱗取自牡丹江市新瑪特超市(新鮮的各種魚(yú)鱗混合物)。BALB/C小鼠,雌雄各半,體重18~20g;3日齡內(nèi)I1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品,ELISA試劑盒為RD公司產(chǎn)品,引物由上海生工生物工程有限公司合成,SYBRPremixExTaqTM為TaKaRa公司產(chǎn)品?！　?.2方法　　1.2.1魚(yú)鱗膠原蛋白膜制備:①魚(yú)鱗前處理:新鮮

4、魚(yú)鱗清水沖洗→烘干→1%鹽酸溶液脫鈣→清水、蒸餾水沖洗→調(diào)pH值→烘干,備用。②水提法制備魚(yú)鱗膠原蛋白膜:取適量經(jīng)處理魚(yú)鱗,搗碎,按1∶30比例加入蒸餾水,100℃水浴30min,80℃水浴1.5h,4℃、8000r/min離心20min,取上清,經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾除菌后,于超凈臺(tái)內(nèi)自然干燥后即得魚(yú)鱗膠原蛋白膜。③膠原蛋白含量測(cè)定:采用對(duì)二甲基氨基苯甲醛比色法測(cè)定膠原蛋白特征氨基酸-羥脯氨酸的含量,測(cè)得值11.1即為膠原蛋白的量。提取率=提取的膠原蛋白量/魚(yú)鱗中總的膠原蛋白量100%?！　?.2.2魚(yú)鱗膠原蛋白對(duì)大鼠真皮成纖維細(xì)胞增

5、殖的影響:大鼠真皮成纖維細(xì)胞分離:取3日齡內(nèi)的TT法檢測(cè)魚(yú)鱗膠原蛋白對(duì)大鼠真皮成纖維細(xì)胞增殖的影響:取適量無(wú)菌膠原蛋白膜,用1640培養(yǎng)液溶解制成濃度為5、10、20、40mg/L液體,與生長(zhǎng)狀態(tài)良好的大鼠真皮成纖維細(xì)胞4103個(gè)共同培養(yǎng)于96孔板中,未加膠原蛋白孔為空白對(duì)照。培養(yǎng)48h后,每孔加入MTT溶液(5g/L)20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清,每孔加入DMSO溶液150μL,振蕩10min,于490nm處檢測(cè)吸光度(OD)值。增殖率E(%)按以下公式計(jì)算。E(%)=(A樣品-A0)/A0100%(A0為空白對(duì)照組吸光度值;A樣品為膠原蛋白組吸光度值)?！　?.2.3免疫低

6、下小鼠皮膚損傷模型制備:利用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠免疫低下。將小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg,每天1次,連續(xù)2天,建立小鼠免疫低下模型。隨機(jī)取正常小鼠10只,作為正常組;取免疫低下小鼠40只,隨機(jī)分為4組(模型組、魚(yú)鱗膠原蛋白1mg、0.5mg、0.25mg組)。乙醚麻醉,背部去毛,消毒,用特制打孔器在小鼠背部打一直徑為1cm的圓形孔,切除皮膚全層。造模第1天,正常組、模型組傷口處覆蓋無(wú)菌紗布,魚(yú)鱗膠原蛋白組傷口處覆蓋含量為1mg、0.5mg、0.25mg的魚(yú)鱗膠原蛋白膜,每日更換紗布及給藥1次,觀察傷口愈合情況,并將創(chuàng)面描記在半透明紙上,計(jì)算創(chuàng)面面積大小,按以下公式計(jì)算創(chuàng)面愈合率,創(chuàng)面愈合率

7、(%)=(開(kāi)始創(chuàng)傷面積-未愈合創(chuàng)面面積)/開(kāi)始創(chuàng)傷面積?！　?.2.3.1檢測(cè)PDGF、TGFβmRNA表達(dá):皮膚損傷后第5、7、10天切取模型組、魚(yú)鱗膠原蛋白1mg組、正常組傷口組織,勻漿器研磨,利用Trizol試劑法提取RNA。取1μgRNA利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶法合成cDNA。PCR采用SYBRGreen染料法,PDGF上游引物為5'-CCTGCCCATTCGGAGGAAGAG-