細粒棘球絳蟲成蟲全長cdna質(zhì)粒文庫的構(gòu)建及鑒定

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1、細粒棘球絳蟲成蟲全長cDNA質(zhì)粒文庫的構(gòu)建及鑒定：呂剛，蘆亞君，范志剛，史大中，王虎，韓秀【摘要】　　目的：構(gòu)建細粒棘球絳蟲（E.g.）成蟲全長cDNA質(zhì)粒文庫，并檢測文庫質(zhì)量。方法:提取E.g.成蟲mRNA，應(yīng)用SMART方法構(gòu)建pBluescriptIISK全長cDNA質(zhì)粒文庫，檢測文庫的重組率及容量；用載體克隆位點兩端的引物進行PCR擴增，檢測插入片段大小。隨機挑選陽性重組克隆5′端測序，歸并unigene，計算unigene得率，全長性判定主要根據(jù)同源全長基因5'末端進行比較判定并計算全長率。結(jié)果:成功構(gòu)建E.g.成蟲全長cDNA質(zhì)粒文庫。文庫的重組率為95.04%，庫容量

2、1.13×106；平均插入片段長度約為1.2kb。24個隨機陽性克隆測序，unigene比例為69.57%，全長性比率為64.71％。結(jié)論:成功構(gòu)建E.g.成蟲全長cDNA質(zhì)粒文庫，文庫質(zhì)量良好?！娟P(guān)鍵詞】細粒棘球絳蟲；成蟲；全長cDNA質(zhì)粒文庫；構(gòu)建；鑒定　?。跘BSTRACT］Objective:ToconstructandevaluatefullLengthcDNAlibraryofadultEchinococcusgranulosus（E.g.）.Methods:mRNAtheadultE.g.andusedfortheconstructionoffulllengthc

3、DNAlibraryusingSMARTpBluescriptⅡSKkit.Therebinationrateandcapabilityofthelibraryeasuredandthelengthofinsertfractionofthepositiverebinantcloneslyselectedfor5'endsequencingandtheratesofunigene,fulllengthcDNAatics.Results:ThefulllengthcDNAlibrayofadultE.g.lyselectedidlibraryofadultE.g.hasbeenc

4、onstructedsuccessfully.　?。跭EYARTIV寡核苷酸，CDSIII/3JPCR引物，pBluescriptIISK的改造載體（將EcoRI和NotI之間的序列改造為SfiIA和SfiIB接頭序列），由上海聯(lián)合基因公司合成和提供；DH5α感受態(tài)菌，通用合成引物M13+/M13，異丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）和xgal為上海生工生物工程技術(shù)有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒抽提試劑盒，荷蘭QIAGEN公司產(chǎn)品；DYEnamicTMETDYETerminatorKit（MegaBACETM）為美國AmershamBiosciences產(chǎn)品；MilliQ水純化系統(tǒng)

5、，美國Millipore公司產(chǎn)品；SpectraMaxPlus384連續(xù)波長酶標(biāo)儀，美國MolecularDevices公司產(chǎn)品；FR280電泳儀，上海復(fù)日公司產(chǎn)品；HYBAIDPCREXPRESSPCR儀，英國ThermoHybaid公司產(chǎn)品；ABIPRISM3700測序儀，美國PEABI公司產(chǎn)品。　　1.2方法　　1.2.1全長cDNA質(zhì)粒文庫的構(gòu)建　　1.2.1.1樣品總RNA抽提及mRNA純化　　按提取試劑盒操作說明書抽提總RNA產(chǎn)物，于260nm及280nm測吸光度（A260及A280），計算A260/A280比值判定純度（純RNAA260/A280=1.9-2.1），

6、1.1%瓊脂糖電泳檢測RNA完整性?！　「鶕?jù)QIAGEN公司的OligotexmRNAKits操作說明書進行分離，A260及A280檢測及1.1%瓊脂糖電泳檢測抽提結(jié)果?！　?.2.1.2cDNA第一鏈合成　　0.5mL滅菌離心管中加入以下試劑：2μg樣品RNA，1μLSMARTIVOligonucleotide，1μLCDSIII/3'PCRPrimer，加水補足5μL，混勻試劑并稍離心，72℃溫浴2min，冰浴2min，稍離心后加入下列試劑：2.0μL5×FirstStrandBuffer，1.0μLDTT(20mmol/L)，1.0μLdNTPMix(10mmol/L)，1

7、.0μLPoer，2μLCDSIII/3'PCRPrimer，2μL50×Advantage2PolymeraseMix，總反應(yīng)體系100μL。輕拍混勻，稍離心后置于已預(yù)熱PCR儀，按下面程序開始PCR：95℃1min，26cycles;95℃15sec，68℃6min。循環(huán)結(jié)束后取5μL樣品1.1%瓊脂糖電泳檢測?！　?.2.1.4PCR產(chǎn)物純化　　合并LDPCR產(chǎn)物至0.5mL菌離心管中，加入2μL蛋白酶K（20μg/μL），混勻試劑并稍離心，45℃溫浴20mi