轉(zhuǎn)ssbhmt基因擬南芥耐缺硫性評價及其導入基因的表達概述

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1、轉(zhuǎn)SsBHMT基因擬南芥耐缺硫性評價及其導入基因的表達概述1引言1.1甲硫氨酸在植物中的合成代謝SAM也是植物中重要的甲基供體[3]，參與生物體內(nèi)的多個初級代謝和次級代謝，包括合成脂質(zhì)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、生物堿、植物甾醇類等。因此，甲硫氨酸通過SAM調(diào)節(jié)植物中重要的細胞過程，如細胞分裂，細胞壁的合成，以及生物膜的合成[4]。在植物代謝途徑中，天冬氨酸通過一系列代謝生成O-磷酸高絲氨酸（OPH），OPH有兩條代謝途徑，一是在蘇氨酸合成酶（TS）的催化下生成蘇氨酸；二是在胱硫醚γ-合成酶（CGS）催化下生成胱硫醚，胱硫醚代謝成高半胱氨酸，高半胱氨酸在甲硫氨酸合成酶的催化下生

2、成甲硫氨酸，而甲硫氨酸合成酶（MS）有兩種類型，一種需維生素B12作輔酶，催化高半胱氨酸與MTHF（5-CH3-THF，5-甲基四氫葉酸）形成甲硫氨酸；另一種不依賴于維生素B12，由多谷氨酰化MTHF提供甲基[5-6]。甲硫氨酸合成的代謝途徑中，CGS（胱硫醚γ-合成酶）是該途徑的一個重要調(diào)節(jié)酶，該酶在擬南芥中的超表達可以使甲硫氨酸含量大量增加。而且此酶的活性并不受甲硫氨酸及其代謝產(chǎn)物的反饋抑制[7]，然而擬南芥CGS（AtCGS）的轉(zhuǎn)錄水平受甲硫氨酸的下游產(chǎn)物SAM的負調(diào)控[8-9]。這個區(qū)域位于AtCGS的N端，包含大約100個氨基酸。這個N端區(qū)域（MTO1）并不是AtC

3、GS催化活性部位所必需的，但是在植物中影響甲硫氨酸和它的代謝物水平。在擬南芥突變體中N端保守域的突變使甲硫氨酸的含量相較野生型提高了40倍[10]。SAMS與該區(qū)域的結合不僅導致CGS的翻譯受阻，也使mRNA發(fā)生降解。AtCGSN端的另外一個調(diào)控域靠近MTO1區(qū)。這個區(qū)域是在另一種AtCGSmRNA中發(fā)現(xiàn)的，它在N端缺失了90個核苷酸。轉(zhuǎn)基因煙草過表達這種缺失的AtCGS表現(xiàn)出不受甲硫氨酸的反饋抑制[11]。這種轉(zhuǎn)基因植物的甲硫氨酸含量與轉(zhuǎn)化全長的AtCGS相比提高了2倍。在馬鈴薯塊莖中過表達這種缺失類型的AtCGS，它的甲硫氨酸含量與野生型相比提高了6倍。因此證明，相同的CGS活性的調(diào)

4、節(jié)可能由不同的機制調(diào)控。1.2硫素營養(yǎng)對作物的影響1.2.1硫的營養(yǎng)功能在植物的生長過程中，硫是必需的礦質(zhì)營養(yǎng)元素之一，硫在植物生理上有如下的功能：第一、硫是胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸的重要組成成分，而這些含硫氨基酸是蛋白質(zhì)的主要成分，在植物體內(nèi)約有90%的硫存在于含硫氨基酸中；第二、硫與葉綠素形成有關；第三，硫?qū)χ参矬w內(nèi)某些酶的形成和活化有重要作用；第四、硫參與合成維生素H和B；第五、形成十字花科植物的糖苷油；第六、硫與影響到植物抗寒和抗旱性的蛋白質(zhì)結構有關，硫能增加某些作物的抗寒和抗旱性。當植物遭遇逆境時，往往造成其體內(nèi)的活性氧代謝失調(diào)，產(chǎn)生大量的氧自由基，生物膜經(jīng)氧自由基攻擊后出現(xiàn)質(zhì)

5、脂過氧化過程，導致細胞或組織損傷，膜脂多不飽和脂肪酸減少，反應尾產(chǎn)物有醛類物質(zhì)（如丙二醛）和以碳為中心的自由基出現(xiàn)。植物體內(nèi)的一些含硫化合物（如谷胱甘肽）可通過一些生化反應途徑淬滅這些游離基團，從而提高植物體的抗逆性[49]。第七、硫與根瘤菌和自生固氮菌的固氮作用有關。作物缺硫，影響其正常生長，導致產(chǎn)量、質(zhì)量均下降[50]。2材料與方法2.1試驗材料擬南芥轉(zhuǎn)基因型10f由農(nóng)桿菌介導沾花法轉(zhuǎn)化豬肝臟BHMT基因（SsBHMT）獲得。現(xiàn)10f與擬南芥野生型biaecotype）以及已轉(zhuǎn)化目的基因的大腸桿菌BL21菌株保存于河北農(nóng)大生命學院生物化學與分子生物學實驗室。2.1.2主要試劑1)目的

6、蛋白的純化：平衡緩沖液：8mol/L尿素，0.1mol/L磷酸二氫鈉，0.01mol/LTris-HCl（pH8.0）。2）SDS-PAGE緩沖液：10電泳緩沖液：30.3gTris，144g甘氨酸，SDS10g，定容至1000mL；Tris緩沖液(pH8.8)：36.3gTris，48mL1mol/LHCl，定容至100mL；Tris緩沖液(pH6.8)：5.98gTris，48mL1mol/LHCl，定容至100mL；10%APS緩沖液：稱取0.1g過硫酸銨，定容至1mL；上樣緩沖液(4)：SDS0.8g，甘油3mL，β-羥基乙醇1mL，Tris緩沖液(pH6.8)2.5m

7、L，溴酚藍2mg，雙蒸水定容至10mL；30%丙烯酰胺母液：29.2g丙烯酰胺（Acr），0.8g甲叉雙丙烯酰胺（Bis）定容到100mL，濾紙過濾，4℃避光保存?zhèn)溆茫豢捡R斯亮藍R-250染色液(500mL)：甲醇250mL，去離子水200mL，冰乙酸50mL，R-2500.625g。2.2試驗方法2.2.1擬南芥的種植擬南芥野生型和轉(zhuǎn)SsBHMT基因型種子分別用75%的乙醇消毒1-2min，吸去乙醇，加入0.5％NaClO震蕩洗滌