人mt1h基因?qū)Ψ蜗侔┘?xì)胞a549增殖的影響及其機(jī)制論文

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1、人MT1H基因?qū)Ψ蜗侔┘?xì)胞A549增殖的影響及其機(jī)制論文侯新芳，樊青霞，王留興，王瑞林，陸士新，趙培榮【摘要】目的研究外源性人金屬硫蛋白1H（MT1H）基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)的影響及其機(jī)制。方法構(gòu)建MT1H基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（）MT1H,以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，獲得陽(yáng)性單克隆細(xì)胞。用RTPCR和T1HmRNA和蛋白表達(dá).freelRNA水平明顯升高。結(jié)論MT1H能夠促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞A549增殖，可能和上調(diào)cyclinD1促使細(xì)胞進(jìn)入S期增多有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】肺癌

2、；金屬硫蛋白1H；細(xì)胞增殖；cyclinD1Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectsofexogenousMT1HgenestablytransfectionongroacellA549invitro.MethodsArebinanteukaryoticexpressionplasmidpcDNA3.1（）MT1Hine2000.PositivemonocloneRNAandproteinrespectively.Thecellproliferationinedby

3、MTTassay.Thealterationsofcellcycleinedbyfloetry(FCM).ThentheexpressionofcyclinD1mRNAinedbyRTPCR.ResultsMT1HmRNAandproteinberofG0/GlphaseobviouslydecreasedberofSphaseincreased,cyclinD1mRNAlevelselevated.ConclusionMT1Hcouldpromoteproliferationoflungadenocarci

4、nomacellA549byupregulatingexpressionofcyclinD1tofacilitatecellsintoSphase.Keya;MT1H;Cellproliferation;cyclinD10引言金屬硫蛋白（MTs）是一類富含半胱氨酸，缺少芳香族殘基的低分子量蛋白質(zhì)。人MT基因位于染色體16q13，包括10個(gè)功能性基因和7個(gè)非功能性基因1。功能性基因包括：MT2A、MT1A、MT1B、MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1X、MT3、MT4。目前很多研究

5、發(fā)現(xiàn)MT和腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)2。ECRG2基因是通過(guò)mRNA差異顯示技術(shù)，利用正常食管血組織和來(lái)自林縣的三對(duì)高癌家族分離與鑒定的新基因3。CuiY等4通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)ECRG2和MT1H有相互作用。進(jìn)一步研究MT1H和ECRG2具體如何相互作用，首先需要明確MT1H的功能。本實(shí)驗(yàn)我們首先構(gòu)建攜帶MT1H基因的重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1／mychis（）MT1H，然后對(duì)轉(zhuǎn)染該基因的肺癌細(xì)胞A549的增殖特性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。1材料與方法1.1細(xì)胞株、菌株和載體肺腺癌細(xì)胞A549由本室保存。真核表達(dá)載

6、體pcDNA3.1/mychis（）B、DH5a菌株、含pACT2MT1H的DH5a菌株來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所病因室。1.2主要試劑TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、XbaI和BamHI內(nèi)切酶、100bpLaddermarker、DNA膠回收試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均為Takara產(chǎn)品。LipofectamineTM2000、TRIZOL均為Invitrogen公司產(chǎn)品。MTT為Sigma公司產(chǎn)品。鼠抗人His抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司。引物由北京奧科生物公司合成。

7、1.3目的基因的擴(kuò)增據(jù)MT1H全長(zhǎng)cDNA序列及pcDNA3.1/mychis（）質(zhì)粒圖譜，設(shè)計(jì)一對(duì)引物：P1：5′TGATCTAGAATGGACCCCAACTGCTCC3′，在上游引物5′端引入XbaI酶切位點(diǎn)；P2：5′GATGGATCCGGCACAGCAGCTGCAC3′，在下游引物5′端引入BamHI酶切位點(diǎn)。以質(zhì)粒pACT2MT1H為模板，擴(kuò)增MT1HcDNA。PCR條件為：94℃變性30sec，56℃退火35sec，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。1.

8、4pcDNA3.1()MT1H重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定用XbaI、BamHI分別雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pcDNA3.1（），1.5％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠回收試劑盒回收目的片段，于4℃在T4DNA連接酶作用下連接過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選Amp抗性克隆，最后用PCR、雙酶切、測(cè)序方法鑒定陽(yáng)性克隆，命名為pcDNA3.1（）MT1H。1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染和陽(yáng)性克隆篩選參照Lip