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《探討微生態(tài)制劑對斷奶仔兔腸道免疫功能的作用》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、探討微生態(tài)制劑對斷奶仔兔腸道免疫功能的作用 斷奶仔兔的生長發(fā)育尚未完全,抵抗外界環(huán)境的調(diào)節(jié)機(jī)能較差,容易產(chǎn)生腹瀉、腹脹和球蟲等疾病,降低了日增重和飼料報(bào)酬,發(fā)病率和死亡率增加.飼養(yǎng)者往往通過添加抗生素來增強(qiáng)仔兔的抗病力,而抗生素在預(yù)防和治療家兔疾病上的濫用現(xiàn)象,常常引起細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和腸道菌群紊亂,造成二次感染.微生態(tài)制劑以其無污染、無殘留、安全可靠、不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè).研究者發(fā)現(xiàn),飼喂微生態(tài)制劑可以調(diào)節(jié)仔鵝盲腸微生態(tài)菌群,提高機(jī)體免疫力和生長性能,同時(shí)增強(qiáng)斷奶仔兔的抗病力,降低料肉比,減少腹瀉率,提高斷奶仔兔的生產(chǎn)性
2、能. 1997年變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE)首次應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究,并證實(shí)該技術(shù)在研究自然界微生物群落遺傳多樣性和種群差異方面具有顯著優(yōu)越性.在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中,DGGE逐漸應(yīng)用于牛、羊、豬和雞等動物腸道菌群多態(tài)性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究,在兔腸道的研究中應(yīng)用還較少. 白秀娟等(2012)研究結(jié)果表明,PCR-DGGE完全可以用于斷奶后仔兔腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究,從而彌補(bǔ)了傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力和精確度差的缺陷.本文旨在通過測定添加微生態(tài)制劑后回腸SIgA的分泌量,探討微生態(tài)制劑對斷奶仔兔腸道免疫功能的作用,并從分子水平探討腸道菌
3、群的變化,為其在畜牧業(yè)中應(yīng)用提供參考. 1材料與方法 1.1材料 肽菌素:購自山東寶來利來生物工程股份有限公司,主要由高活性抑菌型枯草芽孢桿菌、乳酸菌及其代謝產(chǎn)物抗菌肽組成,活菌總數(shù)≥1.5108cfu/g. ?？堤?購自山東寶來利來生物工程股份有限公司,主要由高效抑菌型芽孢桿菌、乳酸菌、細(xì)菌素、抗菌肽及腸道修復(fù)因子組成,活菌總數(shù)≥3.0108cfu/g. 布恩氏固定液、蘇木精和伊紅染色液:由山東寶來利來生物工程股份有限公司生物研究院實(shí)驗(yàn)室自制. SIgA檢測試劑盒:購自普天試劑公司. 糞便基因組提取試劑、PCR
4、擴(kuò)增試劑:購自TIANGEN公司. 實(shí)驗(yàn)設(shè)備:切片機(jī)、酶標(biāo)儀、PCR儀、DGGE電泳儀(Bio-Rad)、脫色搖床. 1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)與日糧組成 試驗(yàn)采用單因子完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),選用剛斷奶仔兔120只,平均體重為513g.隨機(jī)分為4組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10只兔.對照組飼喂基礎(chǔ)日糧(參考正常兔料營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)),試驗(yàn)1~3組分別在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上添加肽菌素(120g/t)、復(fù)合肽菌素(120g/t)和鋅酵母(150g/t)以及常康泰(500g/t).基礎(chǔ)日糧根據(jù)當(dāng)?shù)厝馔玫臓I養(yǎng)水平配制,日糧組成及營養(yǎng)水平見表1. 1.3飼養(yǎng)管理
5、斷奶仔兔采用籠養(yǎng)方式,每籠2~3只.試驗(yàn)期間僅提供顆粒料,不飼喂其他精青粗飼料.每天早晚定時(shí)喂料,自由采食、飲水.搞好兔舍衛(wèi)生工作,保證兔舍溫暖、干燥、清潔,統(tǒng)一免疫和驅(qū)蟲. 1.4樣品采集 試驗(yàn)期結(jié)束后,將各組兔處死后解剖,取一段回腸,沖洗干凈后于10%的福爾馬林溶液中固定用于觀察小腸絨毛,另取一段回腸(連同內(nèi)容物)-80℃保存,用于測定SIgA的表達(dá)量,最后取盲腸內(nèi)容物,將每組每個(gè)重復(fù)內(nèi)10只兔的盲腸糞便做等份混合,即每個(gè)組有3個(gè)盲腸糞便樣品,再將這3個(gè)樣品做等份混合形成第4個(gè)樣品,即每組有4個(gè)樣品用于檢測微生物菌群的變化. 1
6、.5測定指標(biāo)及方法 1.5.1兔回腸絨毛觀察 截取一小段兔回腸包埋在石蠟中,使用切片機(jī)橫向切片后脫蠟,布恩氏固定液固定5min后乙醇洗滌,蘇木精、伊紅染色各30min,最后用加拿大樹膠封片.置45℃溫箱中烘烤過夜后進(jìn)行鏡檢. 1.5.2兔回腸SIgA抗體水平的測定 準(zhǔn)確截取1cm腸段,用剪刀縱向剖開.加入5mLPBS緩沖液,漩渦震蕩1min.8000r/min離心5min,取上清液,移入新的離心管.取的上清液12000r/min離心10min后取上清液為待測樣品,用ELISA試劑盒檢測. 1.5.3兔腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化 每個(gè)試
7、驗(yàn)組稱取糞便樣本180~220mg至干凈的2mL離心管,離心管置于冰盒上.按照糞便基因組提取試劑盒說明書的步驟提取兔糞便總DNA.以提取的DNA直接作為PCR模板,采用細(xì)菌16SrRNA基因V3區(qū)通用引物對:GC-357F(5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和517R(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'),引物由上海生工合成.PCR反應(yīng)體系25μL:2Taqmix12.5μL,上、下游引物(
8、10umol/L)各1μL,模板DNA1μL,無菌雙蒸水9.5μL.PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性4min;94℃變性1min,65℃退火45s,退火溫度每個(gè)循環(huán)降低0.5℃
