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1、人骨形成蛋白論文魚兵，范清宇，馬保安，周勇，張明華，龍華，閆露【關(guān)鍵詞】基因克隆【Abstract】AIM:ToconstructthereplicationdeficientrebinantadenovirusesAdBMP7andtoinvestigateBMP7expressionofAdBMP7inrabbitbonemarrocells(BMSc).METHODS:HumanBMP7cDNAplifiedbyRTPCRmethodfromhumanfetalkidneyandclonedintoshuttlevectortogeneratepAdT
2、rackCMVBMP7eIandthentransformedintoAdEasier1petentcellsbearingadenoviralbackboneplasmidtoobtainrebinantadenoviralplasmidpAdBMP7.Therebinantsedbyrestrictionendonucleaseanalysis.ThepAdBMP7eandtransfectedinto293cellstogetpackedadenovirusesRNAexpressionofBMP7inrabbitBMScethodandtheexpr
3、essionofgreenfluorescenceproteinicroscope.RESULTS:A1296bpcDNAplifiedbyRTPCRfromhumanfetalkidneyanditssequenceanalysisentedasexpected.TherebinantplasmidpAdBMP7ologousrebinationandconfirmedbyrestrictionendonucleasedigestion.GFPexpressioncouldbeobservedonthethirddayafterthepackingofth
4、elinearizedpAdBMP7in293cellsand3×109efu/LtiterofAdBMP7edbyRTPCRandobservedicroscope72hoursaftertherabbitBMScanBMP7geneissuccessfullyclonedanditsrebinantadenovirusesareconstructed.Ourdatamayofferanovelapproachtolocalgenetherapyofboneregeneration.【KeyanBMP7;genecloning【摘要】目的：克隆人骨形成蛋白
5、7(BMP7)基因并構(gòu)建其重組腺病毒，觀察其在兔BMSc中的表達(dá).方法：用RTPCR方法從人胎腎組織中克隆人BMP7基因全長cDNA并測序；將BMP7基因cDNA克隆到穿梭載體形成轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAdTrackCMVBMP7.freeleI酶切線性化后與骨架質(zhì)粒感受態(tài)細(xì)胞AdEasier1Cells經(jīng)電穿孔法同源重組得到腺病毒質(zhì)粒pAdBMP7并酶切鑒定，PacI酶切線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞包裝后獲得復(fù)制缺陷型重組腺病毒AdBMP7，將AdBMP7體外感染兔BMSc后，以RTPCR方法及觀察AdEasy系統(tǒng)上的綠色熒光蛋白表達(dá)鑒定BMP7基因的表達(dá).結(jié)果：用RTPC
6、R方法從胎腎組織中克隆出1296bp的cDNA，測序證實(shí)為人BMP7基因；酶切鑒定表明BMP7基因已插入到pAdTrackCMV穿梭質(zhì)粒且腺病毒重組質(zhì)粒pAdBMP7構(gòu)建成功；經(jīng)293細(xì)胞包裝3d后可觀察到綠色熒光蛋白表達(dá)(GFP)，氯化銫梯度離心法最終獲得約3×109efu/L滴度的重組病毒；體外感染兔BMSc后RTPCR方法及熒光顯微鏡證實(shí)BMP7基因可在兔BMSc中表達(dá).結(jié)論：成功克隆人BMP7基因并構(gòu)建其重組腺病毒，證實(shí)了其在BMSc的表達(dá)，為骨再生的局部基因治療打下基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】腺病毒；表達(dá)載體；人骨形成蛋白7；基因克隆0引言人骨形成蛋白7(bo
7、nemorphogeicprotein7,BMP7)又稱成骨蛋白1(osteogenicprotein1,OP1)是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族的成員，具有廣泛的生理功能及較強(qiáng)的骨誘導(dǎo)能力［1-3］.隨著基因治療技術(shù)及組織工程的發(fā)展，將成骨作用較強(qiáng)的誘骨因子基因?qū)牍撬杌|(zhì)干細(xì)胞期望獲得BMP在局部的持續(xù)釋放而發(fā)揮其誘骨作用成為骨再生及骨缺損修復(fù)的較為理想的方法.我們利用AdEasy腺病毒表達(dá)系統(tǒng)介導(dǎo)BMP7轉(zhuǎn)導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞并觀察其體外表達(dá)，為進(jìn)一步的骨再生及骨缺損的局部基因治療奠定良好基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料AdEasy腺病毒表達(dá)由美國TongChuanHe博
8、士惠贈，人胚腎293細(xì)胞、pT7Blue測序載體、大
