vc發(fā)酵菌種的選育及其技術(shù)發(fā)展

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1、VC發(fā)酵菌種的選育方法及其技術(shù)目前，VC發(fā)酵工藝有萊氏法（以葡萄糖為原料，經(jīng)催化加氫制取D-山梨醇，然后用醋酸菌發(fā)酵生成L-山梨糖，再經(jīng)酮化和化學(xué)氧化，水解后得到2-酮基-L-古洛糖酸（2-KLG），再經(jīng)鹽酸酸化得到VC）,二步發(fā)酵法（發(fā)酵、提取和轉(zhuǎn)化三大步驟，即D-山梨醇先經(jīng)細(xì)菌氧化為L-山梨糖，再通過細(xì)菌發(fā)酵生成VC前體2-KLG，最后用化學(xué)法將2-KLG轉(zhuǎn)化為VC）,新二步發(fā)酵法（葡萄糖串聯(lián)發(fā)酵法）和一步發(fā)酵法（采用重組DNA技術(shù)，構(gòu)成工程菌，實現(xiàn)從D一葡萄糖到2一KLG的一步發(fā)酵）VC發(fā)酵過程的菌種選育技術(shù)焦鵬等(1997)運用SMA探針技術(shù)與HB-HG影印技術(shù)篩選得到了一株蛭弧菌

2、J26,搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生2-KLG的發(fā)酵單位為50-60mg/ml。通過優(yōu)化發(fā)酵條件,該菌株的發(fā)酵單位已達(dá)到83.9–91.7%許安等(1998)利用離子注入技術(shù)（離子注入在維生素C的一步發(fā)酵高產(chǎn)菌株選育中的研究，利用離子束誘變育種技術(shù)選育維生素C一步發(fā)酵高產(chǎn)菌）選育出的2-KLG高產(chǎn)菌系IPPM-1028的山梨糖轉(zhuǎn)化率比由氧化葡萄糖酸桿菌和巨大芽孢桿菌組成的出發(fā)菌系高出18.8%。發(fā)酵周期為60—64h,2-KLG濃度可達(dá)70mg/mL左右，轉(zhuǎn)化率為95%。對Vc生產(chǎn)二步混合菌的生長特性、發(fā)酵規(guī)律的研究,制定了最佳誘變方案,確定了最佳注入離子和最適注入劑量.該論文提出葡萄糖一步發(fā)酵新的途徑,

3、并就此展開了卓有成效的研究工作,在投糖4﹪的情況下,對葡萄糖—古龍酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)58.6﹪,居國內(nèi)外領(lǐng)先水平.基于離子注入對細(xì)胞的刻蝕效應(yīng),開展了離子束介導(dǎo)微生物外源DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo),首次建立了離子注入介導(dǎo)微生物外源DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究體系,在此指導(dǎo)下成功的獲得兩株轉(zhuǎn)基因生物工程菌,并利用分子生物學(xué)方法對轉(zhuǎn)基因菌的遺傳背景進(jìn)行了分析.余曾亮等運用低能離子注入技術(shù)對大菌和小菌進(jìn)行了選育(離子注入在工業(yè)微生物誘變育種中，其損傷輕、突變率高、突變譜廣。比較了H+、N+、Ar+注入Vc生產(chǎn)菌的差異，確定了最佳誘變劑量)，L一山梨糖轉(zhuǎn)化為KGA的轉(zhuǎn)化效率由75％提高到94％，誘變后獲得的GO29一BM279組

4、合體系中，KGA的轉(zhuǎn)化率高達(dá)93.4％，且體系中的pH值趨向于中性，這種環(huán)境更有利于產(chǎn)酸菌的生長代謝和產(chǎn)酸口。隨著空間生物學(xué)的蓬勃興起和迅速發(fā)展，空間飛船搭載菌株已成為另一種重要的誘變技術(shù)。張利平等利用“神舟四號”飛船搭載處理的一批產(chǎn)酸菌株，在418株小菌中篩選出4株糖酸轉(zhuǎn)化率提高4％～5％的小菌，且部分菌株的發(fā)酵周期縮短了20h”。陳建華等(2002)篩選得到的優(yōu)良伴生菌———短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)與氧化葡萄糖酸桿菌混合發(fā)酵生產(chǎn)2-KLG的山梨糖轉(zhuǎn)化率高達(dá)90%。尹光琳等(1997)[選育得到的新組合菌系SCB329-SCB933的發(fā)酵周期僅為40-50h,2-K

5、LG的發(fā)酵單位高達(dá)115-130mg/ml。李越中采用含pUB110質(zhì)粒的小菌轉(zhuǎn)化子（Km(r）St(s)）與Q132(Km(s)St(r)）大菌進(jìn)行原生質(zhì)體融合，獲得可連續(xù)傳代10代以上的小菌，這將為實現(xiàn)小菌的單獨培養(yǎng)以及對小菌的遺傳學(xué)研究打下基礎(chǔ)。張舟等用紫外線誘變法處理巨大芽孢桿菌，獲得了兩株耐低pH值，抗2一KGA的菌株：Bn和B5。Bn和B5分別與氧化葡萄糖酸桿菌搭配，在pH6．2發(fā)酵培養(yǎng)基中平均糖酸轉(zhuǎn)化率提高11．4％9112-3％。仲崇斌等從酵母菌中選出一株擲抱酵母(Sporoblomycesroseus)軍N氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans)混合搭

6、配組成新混合菌系。利用該混合菌系進(jìn)行發(fā)酵，其產(chǎn)酸量增加5—7mg／mL，發(fā)酵周期縮短6～8h，轉(zhuǎn)化率提高34個百分點。呂群燕在對維生素C兩步發(fā)酵法生產(chǎn)工藝的進(jìn)一步研究中，篩選出一個新組合生產(chǎn)菌系H19S19。并利用單親滅活方法通過原生質(zhì)體的融合選育出兩組產(chǎn)生2．KGA產(chǎn)量高且穩(wěn)定性好的重組子：其一為H79和S19原生質(zhì)體以H19為背景進(jìn)行融合產(chǎn)生的，其二為由132和S19原生質(zhì)體以S19為背景進(jìn)行融合重組而產(chǎn)生的利用基因工程技術(shù)進(jìn)行代謝修飾的育種技術(shù)陳芳等根據(jù)報道的草生歐文氏菌ATCC21998的2個2一酮基醛糖還原酶基因序列，在體外將其缺失突變后同源重組到出發(fā)菌株基因組上，突變后的草生歐

7、文氏菌的2一酮基醛糖還原酶活只有原菌的1／30，但目前還沒有進(jìn)一步的詳細(xì)報道。從葡萄糖直接一步發(fā)酵生產(chǎn)Vc前體KGA取得了很大進(jìn)展，該法離實際應(yīng)用尚有距離。Boston等在同樣能轉(zhuǎn)化葡萄糖為2，5-DKG的檸檬泛菌中敲除了其葡萄糖脫氫酶基因，保留了另2個膜結(jié)合的脫氫酶(葡萄糖酸脫氫酶和2一酮基一D一葡萄糖酸脫氫酶)，并用丙酮及甲苯處理菌體以增加細(xì)胞的通透性，然后將細(xì)胞固定于反應(yīng)器內(nèi)，同時加入NADPH依賴的2，5-DKG