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1、發(fā)酵菌種的自然選育一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)從自然環(huán)境中分離工業(yè)微生物菌株的方法。2.熟悉無菌操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理土壤是微生物是微生物生長的大本營，水體是微生物生長的第二場所。自然界中微生物種類繁多，而且都是混在一起的，要獲得發(fā)酵菌株，首先必須把它們從混雜的微生物群體中分離出來。分離微生物菌株最基本的方法就是稀釋法。將樣品放于無菌水中，通過振蕩，使微生物懸浮于液體中，然后靜止一段時(shí)間，由于樣品沉降較快，而微生物細(xì)胞體積小沉降慢，會(huì)較長時(shí)間懸浮在液體中。通過對微生物細(xì)胞懸浮液的進(jìn)一步稀釋和選擇性培養(yǎng)，就可以分離出
2、我們需要的目的菌株。基本特征：⑴能在廉價(jià)原料制成的培養(yǎng)基上迅速生長，并能生成較多的發(fā)酵產(chǎn)物。⑵培養(yǎng)條件如溫度、滲透壓等易控制⑶抗雜菌和抗噬菌體能力較強(qiáng)。⑷遺傳穩(wěn)定性高、不易退化。⑸不產(chǎn)生有害的生理活性物質(zhì)或毒素（食品或醫(yī)藥微生物菌株）。本實(shí)驗(yàn)以土壤或淡水微生物的分離為例，介紹發(fā)酵菌株的自然選育方法，若要篩選海洋微生物，在配制培養(yǎng)基及無菌水時(shí)應(yīng)用陳海水代替蒸餾水和生理鹽水，其他操作都一樣。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑1.樣品土壤、水、蘋果2.培養(yǎng)基⑴Zobell2216E瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨5g，酵母膏1g，F(xiàn)ePO40
3、.01g，NaCl10g，瓊脂20g，加水至1000mL，pH7.2~7.4。⑵營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，瓊脂20g，加水至1000mL，pH7.2~7.4。⑶高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，瓊脂20g，加水至1000mL，pH7.2~7.4。⑷蘋果培養(yǎng)基:馬鈴薯（去皮）200g，煮沸20min后過濾，濾液中加蔗糖20g和瓊脂20g，補(bǔ)水至1000mL，pH自然
4、。若要篩選海洋微生物，上述培養(yǎng)基用陳海水（或2%海鹽）配制。3.器材高壓蒸汽滅菌鍋，恒溫干熱滅菌箱，超凈工作臺(tái)，天平，電爐，1mol/LNaOH，刻度搪瓷杯，量筒、漏斗，玻棒，三角瓶，玻璃珠，試管，培養(yǎng)皿、移液管、防水紙等。四、實(shí)驗(yàn)步驟1.培養(yǎng)基制備⑴細(xì)菌分離用Zobell2216E瓊脂培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。⑵寡營養(yǎng)細(xì)菌（oligotrophicbacteria）的分離用稀釋10倍的Zobell2216E瓊脂培養(yǎng)基。⑶放線菌分離用高氏一號培養(yǎng)基。⑷真菌分離用蘋果培養(yǎng)基。通過稱量、溶解、調(diào)節(jié)pH等步驟，配制
5、上述培養(yǎng)基，并配制45mL無菌水（內(nèi)裝幾顆玻璃珠）1瓶，4.5mL無菌水若干支，0.1MPa滅菌30min后備用；另包扎好培養(yǎng)基、移液管和涂布棒等，滅菌，烘干備用。2.倒平板將滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至50℃~60℃，以無菌操作法倒至經(jīng)滅菌并烘干的培養(yǎng)皿中，每皿約20mL。為了防止非目的的菌株的生長，可在真菌培養(yǎng)基中加入鏈霉素使之達(dá)到30mg/L，以抑制細(xì)菌的生長，在細(xì)菌和放線菌培養(yǎng)基中加入制霉菌素使之達(dá)到100mg/L，以抑制真菌生長。冷卻凝固待用。3.微生物分離（涂布法）⑴稱取樣品5g（液體樣品5mL），放入
6、裝有45mL無菌水的三角瓶中，振蕩10min，即為10-1的土壤稀釋液。⑵取4.5mL無菌水4支，用記號筆編上10-2、10-3、10-4、10-5。⑶取10-1的稀釋液，振蕩靜止2min后，用無菌移液管吸取0.5mL上層細(xì)胞懸液加至裝有4.5mL無菌水的試管中，制成10-2稀釋液。同法依次稀釋至10-3、10-4、10-5稀釋液。在稀釋過程中，因從高濃度到低濃度，每稀釋一次應(yīng)更換一只移液管。⑷另取移液管，分別以無菌操作法吸取10-5、10-4、10-3的稀釋液0.1mL（依樣品中微生物的多少選取不同的稀釋
7、度），加至制備好的平板上，用無菌刮刀（涂布棒）涂布均勻。從低濃度到高濃度，可以用同一根移液管或者涂布棒（見圖1-1）。⑸將培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)于恒溫培養(yǎng)箱中，細(xì)菌37℃培養(yǎng)1~2d，真菌30℃培養(yǎng)3~5d，放線菌30℃培養(yǎng)5~7d后觀察。若雜菌干擾不嚴(yán)重，可適當(dāng)延長平板的培養(yǎng)時(shí)間，以便挑取生長速度較慢的菌株。⑹根據(jù)菌落形態(tài)特征，挑取有代表性的單菌落（盡量挑取不同類型的菌落），在相應(yīng)培養(yǎng)基的平板上劃線，直至得到純培養(yǎng)（通過顯微鏡檢查確認(rèn)只有單一形態(tài)的菌株）。純化后的菌株應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上保存。⑺對分離獲得的純
8、培養(yǎng)進(jìn)行特定能力的測定（詳見實(shí)驗(yàn)1-3）。一、注意事項(xiàng)1.培養(yǎng)箱中最好放置一杯水以增加濕度，分離放線菌的平板應(yīng)相對厚一些，避免因培養(yǎng)時(shí)間過長而干掉。2.樣品的貯藏時(shí)間不宜過長，因?yàn)闃悠肥瞧茐牧俗匀惑w，水、熱、氣等因子與原來環(huán)境中的不一樣，如果貯藏時(shí)間稍長，一些“嬌氣”的微生物容易死亡，所以要想從土壤中找出有價(jià)值的微生物，應(yīng)當(dāng)克服這種藏與死的矛盾。3.篩選海洋微生物，應(yīng)用陳海水（或2%海鹽）代替蒸餾水和生理鹽水，其
