豬圓環(huán)病毒pcr檢測方法的建立

《豬圓環(huán)病毒pcr檢測方法的建立》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、豬圓環(huán)病毒PCR檢測方法的建立澎江廖種學2009年第4期豬圓環(huán)病毒PCR檢測方法的建立王東方.,魏戰(zhàn)勇.,崔保安,陳紅英,郭小參,呂曉麗,管倩(1.河南農(nóng)業(yè)關(guān)學牧醫(yī)工程學院,河南鄭州450002;2.河南省動物性食品安全重點實驗室,河南鄭州4500023.河南省動物疫病預防控制中心,河南鄭州450o08)摘要:本研究建立了檢測豬圓環(huán)病毒的PCR方法,并對該方法進行了標準化研究.該方法具有快速,敏感,特異性強等特點,從PCV2感染的細胞中可最低擴增到0.1ng的DNA,且對其它病原微生物如PRV,PPV不

2、能檢出.可對病料,血清提取DNA進行檢測,所有程序在5h內(nèi)得出結(jié)果.該方法可用于PCV2感染豬的快速診斷,引種檢疫,分子流行病學調(diào)查.關(guān)鍵詞:PCR;檢測;豬圓環(huán)病毒中圖分類號:$859.81文獻標識碼:B文章編號:0528—9017(2009)04.0812.04豬圓環(huán)病毒(porcinecireovirus,PCV)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小的一種脊椎動物病毒.根據(jù)PCV的致病性,抗原性及核苷酸序列將PCV分為PCV1和PCV2兩個基因型.PCV1廣乏存在于豬體內(nèi)及豬源代細胞系中,無致病性,不能引起細胞病

3、變;PCV2具有致病性,主要引起一種新發(fā)現(xiàn)的傳染病——斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaningmultisystemicwastingsyderome,PMWS).PMWS主要以進行性消瘦和多系統(tǒng)病理損傷為特征,已給全球養(yǎng)豬業(yè)造成相當嚴重的經(jīng)濟損失.據(jù)報道,1991年P(guān)MWS首發(fā)于加拿大;目前世界其它地方普遍有PMWS發(fā)生的報道.在我國,郎洪武等首次報道我國豬群存在PCV2感染以來,已陸續(xù)有二十幾個省,自治區(qū),直轄市報道有豬圓環(huán)病毒的感染一.對于該病診斷已有病毒分離,免疫熒光法,ELISA方法,

4、免疫組化法等方法.這些方法操作煩瑣,困難,經(jīng)常受到條件制約,原位雜交等.目前廣泛應用的PCR具有較高的敏感性和特異性.然而由于不同的引物之間差別較大,以及PCR擴增時各種因素的影響,使得PCR方法的特異性和敏感性各不相同,因此用于診斷時往往容易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果.我們針對最常見的3種擴增PCV2的引物區(qū)域設(shè)計,比較了對引物的特異性和敏感性,優(yōu)化了PCV2的PCR,診斷方法,建立了檢測與診斷豬圓環(huán)病毒的PCR方法.這將有助于我國豬群PCV2疫情的監(jiān)測,也能為控制該病的傳播提供技術(shù)支持.1材料和方法1.1試驗

5、材料PCV2為中國農(nóng)大楊漢春教授惠贈,豬細小病毒(PPV),偽狂犬(PRV)均為本室保存之毒種.PK15細胞(無PCV1污染)為本室保存.DMEM購自華美生物工程公司;葡萄糖胺購自Sigma公司;無菌胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司.pGEM—Teasy載體購自Promega公司,TaqDNA聚合酶,dNTPs,Mg2,MarkerDL2000購自TaKaRa公司,異硫氰酸胍(GuSCN),飽和平衡酚,酚:氯仿:異戊醇(25:24:1),氯仿:異戊醇(24:1)等均購自上海Sangon有限公司.1

6、.2引物設(shè)計根據(jù)GenBank已發(fā)表的PCV2全基因序列AF027217,選擇ORF1和ORF2設(shè)計3對引物pl/P2,P3/P4和P5/P6(表1).引物由上海生物工程公司合成.1.3病毒培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒株及病毒接種無PCV1污染的50%長滿的PK15細胞系單層細胞(用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),含10%小牛血清,100U青霉素,100g?mL收稿日期:2009.03.21基金項目:河南省杰出人才創(chuàng)新基金項目(0621002100)作者簡介:王東方(1980一),男,河南新鄭人,碩士,從事動物技術(shù)研究工作.注:

7、崔保安系通訊作者,E—mail:baoancui@henau.edu.cn.王東方,等:豬圓環(huán)病毒PcR檢測方法的建立田鏈霉素),37oC培養(yǎng)18h,當細胞增至80%時棄去培養(yǎng)液,用Hank's堿性鹽溶液配制的300mmol?L葡萄糖胺37℃作用30min.換新鮮培養(yǎng)液,至細胞長滿.細胞未出現(xiàn)任何特異性病變,仍保持良好狀態(tài),培養(yǎng)72h,用0.25%胰蛋白酶.EDTA消化,盲傳3代后,取培養(yǎng)液一20℃室溫凍融3次.一70℃保存.1.4PCV模板DN的制備參照分子克隆實驗指南所述DNA提取方法進行.1.5豬

8、圓環(huán)病毒PCR擴增PCV2PCR反應采用50反應體系,其組份如下:10×PCR緩沖液5tLL,MgC12濃度為4mmol?L～,NTPs濃度為200tLmol?L～,Taq酶1U,引物P1,P2濃度為0.5p.mol?L～,模板5,最后用雙蒸餾水補至50p.L.PCR擴增條件為:95oC預變性5min,按95℃1min,55cI=30s,72oC1min,共進行30個循環(huán),然后72℃延伸10min,結(jié)束后用0.8%瓊脂糖凝膠(含0.5ttg