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1、變性高效液相色譜進行HLA作者：王靜波 李丹 潘凱楓 陸道培【摘要】 為了探討通過變性高效液相色譜（DHPLC）進行HLA-DRB1配型的可行性，選擇經(jīng)PCR-SSP證實的20例HLA-DRB1相合及2例HLA-DRB1不相合的病人及其同胞供者的標本為實驗對象，全部標本通過PCR擴增HLA-DRB1第二外顯子基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)梯度變性處理后通過DHPLC檢測，在部分變性溫度下，檢測病人與供者的HLA-DRB1第二外顯子DHPLC峰型是否相同，以判斷供受者的HLA-DRB1基因型是否相同。結果表明：DHPLC與PCR-SSP進行DRB1配型比較分析,經(jīng)kappa檢驗，ka
2、ppa值為0.776，P值＝0.00，說明兩種方法的配型結果無顯著性差別。結論：變性高效液相色譜方法用于HLA-DRB1配型方便,經(jīng)濟實用并解決了HLA新基因的不斷出現(xiàn)與相應的位點的引物或探針設計和開發(fā)的相對滯后之間的矛盾?！娟P鍵詞】DHPLCHLA-DRB1配型PCR-SSP FeasibilityofHLA-DRB1MatchingbyUsingDHPLC AbstractTostudyfeasibilityofHLA-DRB1matchingbyusingdenaturedhighperformanceliquidchromatography（DHPLC），20pa
3、irsofDNAsamplesfromdonorsandrecipientsofhematopoieticcelltransplantation(HCT)forDRB1matchingand2pairsofsamplesfromdonorsandrecipientofHCTforDRB1mismatchingplifiedandannealedsloatchedormismatchedpeaksinchromatogram.TheresultsshoatchedormismatchedHLA-DRB1typing.TheresultsofDHPLCandPCR-SSPform
4、atchingatchingentatchingiseconomicandconvenient,moreover,atching;PCR-SSP 變性高效液相色譜（DHPLC）是一種新型的檢測基因的多態(tài)性的方法［1］。這種方法是根據(jù)含有異源雙鏈的PCR產(chǎn)物中不匹配堿基的種類，數(shù)量及排列順序以及位置的差異產(chǎn)生不同的的DHPLC峰型，從而推測目的基因的多態(tài)性。由于HLA-DRB1片段的高度多態(tài)性，每一個等位基因的多態(tài)堿基的種類，數(shù)量及位置均不相同，其DHPLC峰型也應該不同。通過DHPLC進行供受者樣本的基因型的直接比對，如果供受者的HLA基因型相同，則其DHPLC峰型也應該相
5、同。反之，則DHPLC峰型不相同，從而達到判斷供受者HLA配型是否相合的目的。編碼HLA-DRB1抗原多態(tài)性的基因主要在HLA-DRB1第二外顯子［2］，因此我們的研究重點主要在HLA-DRB1的外顯子2?！ 〔牧虾头椒ā 吮緛碓础 ?2對病人及其同胞供者標本均來自北京大學人民醫(yī)院血液病研究所。 DNA提取 取抗凝血5ml，525×g離心10分鐘。吸出白細胞層，加入紅細胞裂解液10ml，室溫放置20分鐘，365×g離心10分鐘，棄上清，重復2次，然后加入白細胞裂解液3ml，蛋白酶K（10mg/ml）75μl、10%SDS200μl、37℃過夜后加入6mol/L氯化鈉1m
6、l震搖15秒，充分混合后置4℃冰箱20分鐘，2220×g離心20分鐘，將上清液移至另一試管，加入等體積無水乙醇，封口倒轉(zhuǎn)試管數(shù)次至絮狀物折出，將絮狀物移至1mlEP管中，加入75%乙醇0.8ml，16210×g離心1分鐘，重復2次，棄上清，室溫干燥30分鐘，加入300μlTE溶液，DNA溶解后進行定量。 PCR PCR擴增HLA-RB1外顯子2引物為5'GGAGGCCGCCTGTGTGACTG3',5'CCCAGCTCACAGGGACTCAGG3'。擴增片段為353bp,25μlPCR體系包括：50ng基因組DNA,0.2μmol/L引物,200μmol/LdNTP，2U
7、pfu，2mmol/L氯化鎂。擴增條件為94℃4分鐘,94℃45秒，72℃1分鐘20秒，35個循環(huán)，72℃延伸10分鐘?！ RB1的DHPLC分型及比對 PCR產(chǎn)物經(jīng)過95℃3分鐘變性，然后每分鐘降1℃，直至45℃，PCR產(chǎn)物不需純化處理，可直接通過DHPLC在部分變性溫度下進行檢測。流動相為0.1mol/LTEAA（pH7.0）和25%乙腈（acetonitrile），按不同梯度進行混合，部分變性溫度為65.5℃,流速0.9ml/min，PCR產(chǎn)物首先在柱溫50℃下檢測，觀察其DHPLC峰型是否為
