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1、大鼠原代肝細胞分離和培養(yǎng)原代肝細胞分離和培養(yǎng)試劑（1）無鈣灌流液?????NaCl???????????????????????????8.3gKCl?????????????????????????????0.5gHEPES??????????????????????????2.4gEDTA???????????????????????????0.015g青霉素??????????????????????????105U鏈霉素??????????????????????????0.1g用適量超純H2O溶解，1mol·
2、L-1NaOH或1mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH至7.4，加超純H2O定容至1L。（2）膠原酶溶液NaCl???????????????????????????8.0gKCl????????????????????????????0.4gCaCl2??????????????????????????0.56gNa2HPO4·12H2O?????????????????0.134gKH2PO4????????????????????????0.06gNaHCO3????????????????????????0.35g葡萄
3、糖?????????????????????????1.00gHEPES?????????????????????????5.96g用適量超純ddH2O溶解，1mol·L-1NaOH或1mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH至7.5-7.6，加超純H2O定容至1L每次酶灌流液用量25mL，臨用前加入IV型膠原酶12.5mg。（3）HBSS緩沖液NaCl??????????????????????????8.0gKCl???????????????????????????0.4gCaCl2?????????????????????
4、????0.14gMgSO4·7H2O???????????????????0.2gNa2HPO4·12H2O????????????????0.134gKH2PO4???????????????????????0.06gNaHCO3???????????????????????0.35g葡萄糖????????????????????????1.00gHEPES????????????????????????5.96g用適量ddH2O溶解，1mol·L-1NaOH或1mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH至7.4，加超純H2O定
5、容至1L。以上溶液均過濾滅菌。肝細胞的消化分散?采用兩步法：先用無鈣灌流液作預灌流，目的在于沖去殘積血，除去或減少肝細胞間的鈣離子，以減小細胞間的粘著力。然后再用含鈣的膠原酶灌流液灌流，以消化細胞間質(zhì)而分散肝細胞，具體步驟如下：①???預灌流：健康SD大鼠（體重150～200g），禁食8h后，水合氯醛（10%）麻醉，四肢伸展腹部向上背部固定于操作臺上，胸腹部酒精消毒。小心打開腹腔，暴露分離肝門靜脈，用留置針門靜脈插管，動脈夾立即夾緊，剪斷下腔靜脈以37℃無鈣灌流液以流速20mL·min-1開放灌流，并迅速剪斷下腔靜脈以
6、備灌流液順暢流出。先做在位灌流數(shù)分鐘，此時肝臟及其血管解剖位置保持正常，可保證灌流順暢。然后，邊灌流邊剪斷肝臟與周圍組織的聯(lián)系，將肝臟移置肝臟托盤內(nèi)繼續(xù)灌流；注意不要損傷肝包膜，并盡量保持肝葉和血管的正常位置，不可扭曲。灌流過程中肝臟漸漸變?yōu)榛尹S色，灌流時間大約10min。預灌流一般需用灌流液約為300mL左右。②酶灌流：預灌流后換用37℃的通O2的膠原酶灌流液繼續(xù)灌流。灌流速度仍維持20mL·min-1。如果灌流通暢，則肝臟顏色均勻。由于肝細胞間質(zhì)被消化，灌流液進入細胞間隙，因而可見到肝臟逐漸腫脹?？筛鶕?jù)經(jīng)驗，肉眼觀
7、察肝臟腫脹程度來選擇最佳灌流時間，一般酶灌流約需8～15min。③分散肝細胞：以下操作在超凈工作臺內(nèi)進行。在酶灌流達到最佳效果時取下肝臟，將之移至盛有20mLHBSS緩沖液（含10%胎牛血清）的平皿中。用眼科鑷子小心撕去肝包膜，將肝臟在培養(yǎng)液中輕輕振搖，使消化好的肝細胞散落到緩沖液中。操作中要注意盡量輕柔，避免細胞受機械力傷害。過200目不銹鋼網(wǎng)篩，濾去剩余的雜組織，形成肝細胞懸液。肝實質(zhì)細胞的純化：將肝細胞懸液收集在錐形瓶中，于37℃振蕩培養(yǎng)15min。在此期間，受損傷肝細胞進一步排出其內(nèi)容物而變得更輕，易于在離心時
8、與完整細胞分開；懸液在0～6℃條件下以200r·min-1離心3～5min，棄去上清，用PBS以同上條件清洗、離心三次。末次棄上清后以培養(yǎng)液重懸，即可得到絕大部分為肝實質(zhì)細胞的懸液。細胞產(chǎn)量及成活率的測定用血細胞計數(shù)板按血紅細胞計數(shù)方法求得每mL懸液中的細胞數(shù)，再乘以所得肝細胞懸液的總量mL數(shù)，即為細胞產(chǎn)量。用0.6％等張臺盼蘭（
