綠色熒光蛋白gfp原核表達(dá)分析

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1、綠色熒光蛋白(GFP)原核表達(dá)分析石河子大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)課論文綠色熒光蛋白(GFP)原核表達(dá)分析學(xué)生姓名學(xué)號(hào)專業(yè)年級(jí)、班級(jí)指導(dǎo)教師所在學(xué)院中國(guó)·新疆·石河子2016年1月10綠色熒光蛋白(GFP)原核表達(dá)分析綠色熒光蛋白(GFP)原核表達(dá)分析摘要：本實(shí)驗(yàn)主要探討目的蛋白（GFP）在大腸桿菌中的表達(dá)的情況以及鑒定目的蛋白形成的是包涵體還是可溶性蛋白。本實(shí)驗(yàn)先對(duì)菌液進(jìn)行培養(yǎng)、活化、然后采用IPTG分別對(duì)其不同時(shí)間點(diǎn)的誘導(dǎo)，用SDS-PAGE來(lái)確定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握GFP誘導(dǎo)不同時(shí)間的表達(dá)情況的檢測(cè)方法。關(guān)鍵詞：綠色熒光蛋白；SDS-PAGE；原核表達(dá)1前言1.1實(shí)驗(yàn)?zāi)?/p>

2、的掌握聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的原理和操作方法；了解重組載體的構(gòu)建方法；鍛煉學(xué)生查閱文獻(xiàn)資料、設(shè)計(jì)與優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的能力；加強(qiáng)學(xué)生對(duì)化學(xué)生物學(xué)中常用研究方法的認(rèn)知。1.2實(shí)驗(yàn)背景綠色熒光蛋白（greenfluorescentproteinGFP)是源于多管水母屬等海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的發(fā)光蛋白，其在藍(lán)光或紫外光下可發(fā)出明亮的綠色熒光，可以作為報(bào)告基因檢測(cè)蛋白的特異性表達(dá)或進(jìn)行細(xì)胞定位研究。與以往lacZ、CAT等報(bào)告基因相比，有很多無(wú)可比擬的優(yōu)越性:GFP不具有種屬依賴性，在多種原核和真核生物細(xì)胞中都表達(dá)；熒光強(qiáng)度高，穩(wěn)定性高；不需要反應(yīng)底物與其他輔助因子，受藍(lán)光激發(fā)產(chǎn)生綠色熒光,尤其適用于體

3、內(nèi)的即時(shí)檢測(cè)；另外GFP分子量小，易于融合，適用于多種轉(zhuǎn)化方式，對(duì)受體無(wú)毒害,安全可靠；并且通過(guò)替換一些特殊氨基酸，可以使之產(chǎn)生不同顏色的光，從而適應(yīng)不同的研究需要。正是由于GFP檢測(cè)具有高靈敏度，操作簡(jiǎn)單，無(wú)需使用同位素等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)廣泛用于基因的表達(dá)與調(diào)控、蛋白質(zhì)的定位、轉(zhuǎn)移以及相互作用、信號(hào)傳遞、轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化，以及細(xì)胞的分離與純化等研究領(lǐng)域。綠色熒光蛋白還在監(jiān)測(cè)目的基因表達(dá)、研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝及追蹤細(xì)胞系的分化等方面有著廣泛應(yīng)用。采用GFP作為標(biāo)記基因，可直接收集轉(zhuǎn)化細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)，縮短了篩選時(shí)間、減少對(duì)細(xì)胞活性的影響并可作為活體標(biāo)記，為研究發(fā)育的基因調(diào)控和分子機(jī)制提供了一種簡(jiǎn)潔有

4、效的手段。同時(shí)也正因?yàn)槠錈晒夥磻?yīng)不是酶反應(yīng)，所以當(dāng)細(xì)胞本身還存在一些可以受藍(lán)光激發(fā)和產(chǎn)生綠色熒光的物質(zhì)，或者GFP表達(dá)頻率不高的情況下，GFP的檢測(cè)可能會(huì)產(chǎn)生一些假相，不易對(duì)熒光進(jìn)行定量的測(cè)定。我們利用基因工程手段在大腸桿菌中高效的表達(dá)了GFP，制備出GFP抗體，利用抗原與抗體之間的特異性，在體外對(duì)GFP進(jìn)行檢測(cè)，可在一定程度上彌補(bǔ)上述GFP檢測(cè)中可能出現(xiàn)的問(wèn)題，可以作為一種重要的輔助手段用以提高GFP檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度。10綠色熒光蛋白(GFP)原核表達(dá)分析原核表達(dá)是將克隆基因插入合適載體后導(dǎo)入大腸桿菌，用于表達(dá)大量蛋白質(zhì)的方法。選用原核表達(dá)系統(tǒng)的原因是易于生長(zhǎng)和控制、用于細(xì)菌

5、培養(yǎng)的材料不及哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的材料昂貴、有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質(zhì)?？晒┻x擇。但是在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，常形成包涵體而影響表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性及構(gòu)象。包涵體是在某些生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，形成被膜包裹的結(jié)構(gòu)，具有水不溶性的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)主要是通過(guò)SDS-PAGE來(lái)檢測(cè)綠色熒光的原核表達(dá)情況。1.1流程圖：2材料與方法2.1材料2.1.1實(shí)驗(yàn)材料質(zhì)粒DNA;PCR產(chǎn)物、酶切質(zhì)粒、DNAMarker;外源DNA片段：PCR擴(kuò)增回收目的片段A和PGM-Tvector(Amp’

6、,lacZ),帶限制性內(nèi)切酶末端的DNA溶液（目的片段A和載體片段pBL）;E.coliDH-5α受體菌（R-M-），自提的質(zhì)?；蛑亟M子;重組質(zhì)粒DNA的菌落、BL21;重組GFP質(zhì)粒、標(biāo)準(zhǔn)蛋白。2.1.2實(shí)驗(yàn)儀器PCR儀、PCR管、移液槍、離心機(jī)、電泳儀、渦旋振蕩器、冰箱、透射儀、紫外透射儀、刀片、臺(tái)式高速離心機(jī)、恒溫水浴鍋、微量移液槍、Eppendorf管、高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、制冰機(jī)、振蕩培養(yǎng)箱、移液器、搖床、酒精燈、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、酒精棉球、滅菌槍頭、分光光度計(jì)。10綠色熒光蛋白(GFP)原核表達(dá)分析2.1.3實(shí)驗(yàn)試劑模板DNA、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、Buf

7、fer(內(nèi)含Mg2+)、ddH2O、pGM-T載體、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，其它生化試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1PCR擴(kuò)增目的基因片段(1)依次混勻下列試劑，反應(yīng)體系如下：PCR反應(yīng)體系各成分的量ddH2O9.5ml上游引物1.0ml下游引物1.0ml模板DNA1.0mlTaqDNA聚合酶12.5mlTotal25ml混勻后瞬時(shí)離心(2)將PCR管放入PCR儀中，設(shè)定PCR儀的循環(huán)參數(shù)。預(yù)變性94℃3min，變