電鏡膠體金標記方法

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1、（1）超薄切片厚50～70nm左右，載于200～300網(wǎng)孔的鎳網(wǎng)上。（2）置1%H2O2內(nèi)10min至1h（視樹脂的硬度和切片的厚度而定），以去鋨酸和增進樹脂穿透性，有利抗體進入。如切片很薄或于低溫包埋時，此步可省略。操作時，滴入1%H2O2液1滴于蠟板上，將網(wǎng)的載片面輕浮于液滴上。對中樞神經(jīng)系統(tǒng)切片，有主張以1%過碘酸鉀（KIO4）代替H2O2的。（3）雙蒸水洗3次，每次10min，第1，2次洗法如（2），浮于液滴上，第3次以盛雙蒸水的注射器沿鎳網(wǎng)面沖洗，水流應(yīng)有適當壓力，但不宜過高強，用濾紙在網(wǎng)緣將水吸干。（4）浮于正常

2、羊血清（1：50～1：100）滴上，室溫30～60min，以飽和固定劑中的游離醛基占據(jù)非特異性結(jié)合部位。（5）PBS漂洗3min，洗1次（有人主張不洗）。（6）濾紙吸干，孵育于第一抗體血清滴上，先室溫預(yù)孵1h，再置于4℃24～36h。（7）PBS漂洗3min，3次。（8）PBS（內(nèi)含1%的牛血清白蛋白）pH8.2中，5min，此步為膠體金結(jié)合作準備。（9）膠體金標記抗體液1：30～1：100，淡紅色為適宜稀釋液，室溫孵育10min至1h。（10）雙蒸水洗3min，3次?！　∪缱麟p重染色，則應(yīng)將鎳網(wǎng)翻過來，用另一類抗體血清，重

3、復(fù)上述步驟（2）～（10）。膠體金標記蛋白A技術(shù)（ProteinA-goldtechnique,PAg法）　　PAg復(fù)合物制備方法簡便，作為第二抗體，無種屬特異性，可以免去不同種屬動物要制備不同的特異性免疫球蛋白。PAg復(fù)合物與包埋劑和細胞成分都極少發(fā)生非特異性的交互作用，蛋白A和金粒間非共價的結(jié)合特性既不影響蛋白A的活性，又能保持高度的穩(wěn)定性，PAg復(fù)合物分子最小易于穿透組織。PAg復(fù)合物的原液在4℃可保存達一年之久。電鏡水平的PAg染色法PAg法在電鏡技術(shù)的應(yīng)用原則是二步標記法，可用于包埋前和包埋后染色。其主要區(qū)別于一般

4、膠體金免疫染色在：①須1%卵白蛋白－PBs（pH7.4）或1%卵白蛋白—0.05mol/lTris緩沖液（pH7.4）來封閉非特異性的結(jié)合部位，而不是采用羊或其它的動物的正常抗血清，因為PAg復(fù)合物能夠與正常血清組中的Ig結(jié)合，從而給出假陽性結(jié)果；②在應(yīng)用第一抗血清孵育和PBS沖洗后作第二抗血清即PAg復(fù)合物孵育前的準備時，應(yīng)用的PBS或TBS的pH應(yīng)變更為pH8.2。其它可參照本節(jié)中包埋后染色法進行。液體配制：1、膠體金稀釋液配方：（PH＝8.2）的0.02mo1／LTrisTBS緩沖液，加入試劑級卵清白蛋白至1％。｛免疫

5、電鏡按1：20-50稀釋，淡紅色為適宜稀釋液,膠體金稀釋后應(yīng)于當天使用，未用完的應(yīng)該丟棄。（免疫膠體金說明書）｝2、清洗液：0.5mol／L，pH7.4Tris-Hcl緩沖液：Tris，60.57g，1mol／LHcl約420m1，調(diào)pH值至7.4，最后加雙蒸水至1000m1，此為儲備液。0.05mo1／LTris緩沖生理鹽水：氯化鈉8.5-9g；0.5mo1／L，pH7.4Tris-Hcl緩沖液100m1；加雙蒸水至1000m1，調(diào)pH值至7.4。0.02mo1／LTris緩沖生理鹽水：氯化鈉8.5-9g；o.5mo1／L

6、，pH7.4Tris-Hcl緩沖液40m1，加雙蒸水至l000m1，調(diào)pH值至8.2。3、H2O2的配制:3%H2O24、8％過碘酸鈉水溶液5、封閉液：前封閉液：1%卵白蛋白—0.05mo1／LTris緩沖液（pH7.4）；后封閉液以及膠體金稀釋液：1%卵白蛋白—0.02mo1／LTris緩沖液（pH8.2），后封閉為膠體金結(jié)合作準備。具體操作:一、包埋：常規(guī)電鏡制樣，樣品只需要戊二醛固定，不需要鋨酸后固定。丙酮梯度脫水時70％的丙酮中沒有添加染色劑。樣品于37度烘箱中固化。二、切片：超薄切片厚50～70nm左右，載于300

7、網(wǎng)孔的鎳網(wǎng)上。三、抗原修復(fù)：1、置1%H2O2內(nèi)10min至1h（視樹脂的硬度和切片的厚度而定），以去鋨酸和增進樹脂穿透性，有利抗體進入。如切片很薄或于低溫包埋時，此步可省略。操作時，滴入1%H2O2液1滴于蠟板上，將網(wǎng)的載片面輕浮于液滴上。對中樞神經(jīng)系統(tǒng)切片，有主張以1%過碘酸鉀（KIO4）代替H2O2的。（同時用8％過碘酸鈉水溶液代替雙氧水，室溫5～25分鐘以及丙酮對環(huán)氧樹脂進行溶解?？慈吣莻€效果最好）2、雙蒸水洗3次，每次10min，第1，2次浮于液滴上清洗，第3次以盛雙蒸水的注射器沿鎳網(wǎng)面沖洗，水流應(yīng)有適當壓力，但

8、不宜過高強，用濾紙在網(wǎng)緣將水吸干。(0.05mo1／LTBSpH7.4洗5min×3次?)三、封閉以及免疫反應(yīng)：1、載有超薄片的鎳網(wǎng)或金網(wǎng)浮于1%卵白蛋白－TBS（7.4）液滴上，室溫約1h，阻斷非特異性吸附，吸去多余血清，不洗。2、載網(wǎng)直接移至第一抗血清液滴上(抗體稀釋度較常規(guī)免疫組化低