資源描述：
《膠體金標記流程.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、膠體金標記流程（一）?原理?免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術(shù)。膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如檸檬酸三鈉、白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密
2、度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細胞生物學(xué)等領(lǐng)域。免疫金標記技術(shù)(Immunogoldlabellingtechique)主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當(dāng)這些標記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中，這一反應(yīng)也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。（二）?器皿及試劑的處理1.玻璃器皿的清潔制備膠體金的成功與失敗除試劑因素以外玻
3、璃器皿清潔是非常關(guān)鍵的一步。如果玻璃器皿內(nèi)不干凈或者有灰塵落入就會干擾膠體金顆粒的生成，形成的顆粒大小不一，顏色微紅、無色或混濁不透明。我們的經(jīng)驗是制備膠體金的所有玻璃器皿先用自來水把玻璃器皿上的灰塵流水沖洗干凈，加入清潔液（重鉻酸鉀1000g,加入濃硫酸2500ml，加蒸餾水至10000ml）浸泡24h，自來水洗凈清潔液，然后每個玻璃器皿用洗潔劑洗3～4次，自來水沖洗掉洗潔劑，用蒸餾水洗3～4次，再用雙蒸水把每個器皿洗3～4次，烤箱干燥后備用。通過此方法的處理玻璃器皿不需要硅化處理，而直接制備膠體金。也可用已經(jīng)制備的
4、膠體金溶液，用同等大小顆粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面，然后棄去，再用雙蒸水洗凈，即可使用，這樣效果更好，因為減少了金顆粒的吸附作用。2.試劑的配制要求（1）所有配制試劑的容器均按以上要求酸處理洗凈，配制試劑用雙蒸餾水或三蒸餾水。（2）氯化金（HAuCl4）水溶液的配制：將lg的氯化金一次溶解于雙蒸水中配成1%的水溶液。放在4℃冰箱內(nèi)保存長達幾個月至1年左右，仍保持穩(wěn)定。（三）?膠體金的制備1．制備方法膠體金的制備多采用還原法。氯金酸（HAuCl4）是主要還原材料，常用還原劑有檸檬酸三鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼
5、氫化鈉等。根據(jù)還原劑類型以及還原作用的強弱，可以制備0.8nm～150nm不等的膠體金。最常用的制備方法為檸檬酸鹽還原法。具體操作方法如下：（1）將HAuC14先配制成0.01％水溶液，取100ml加熱至沸。（2）攪動下準確加入一定量的1％檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7?2H2O）水溶液。（3）繼續(xù)加熱煮沸15min。此時可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。全過程約2～3min。（4）冷卻至室溫后用蒸餾水恢復(fù)至原體積。用此法可制備16～147nm粒徑的膠體金。金顆粒
6、的大小取決于制備時加入的檸檬酸三鈉的量。表1列舉制備4種不同粒徑膠體金時檸檬酸三鈉的用量。表1四種粒徑膠體金的制備及特性金粒直徑（nm）1％檸檬酸三鈉加入量（ml）膠體金特性呈色λmax162.00橙色518nm24.51.50橙色522nm411.00紅色525nm71.50.70紫色535nm注意事項：（1）易潮解，應(yīng)干燥、避光保存。（2）氯金酸對金屬有強烈的腐蝕性，因此在配制氯金酸水溶液時，不應(yīng)使用金屬藥匙稱量氯金酸。（3）用于制備膠體金的蒸餾水應(yīng)是雙蒸餾水或三蒸餾水，或者是高質(zhì)量的去離子水（18M）。（4）用以
7、制備膠體金的玻璃容器必須是絕對清潔的，用前應(yīng)先經(jīng)酸洗并用蒸餾水沖凈。最好是經(jīng)硅化處理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡數(shù)分鐘，用蒸餾水沖凈后干燥備用。（5）膠體金的鑒定和保存：膠體金的制備并不難，但要制好高質(zhì)量的膠體金卻也并非易事。因此對每次制好的膠體金應(yīng)加以檢定，主要檢查指標有顆粒大小，粒徑的均一程度及有無凝集顆粒等。肉眼觀察是最基本也是最簡單和方便的檢定方法，但需要一定的經(jīng)驗。良好的膠體金應(yīng)該是清亮透明的，若制備的膠體金混濁或液體表面有漂浮物，提示此次制備的膠體金有較多的凝集顆粒。在日光下仔細觀察比較膠體
8、金的顏色，可以粗略估計制得的金顆粒的大小。當(dāng)然也可用分光光度計掃描λmax來估計金顆粒的粒徑。制備的膠體金最好作電鏡觀察，并選一些代表性的作顯微攝影，可以比較精確地測定膠體金的平均粒徑。膠體金在潔凈的玻璃器皿中可較長時間保存，加入少許防腐劑（如0.02％NaN3）可有利于保存。保存不當(dāng)時會有細菌生長或有凝集顆粒形成。少量凝集顆粒并
