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《宮環(huán)止血片對(duì)人子宮內(nèi)膜細(xì)胞影響的分子機(jī)制研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、模型子宮內(nèi)膜顯微形態(tài)學(xué)變化、內(nèi)膜局部一氧化氮、前列環(huán)素、血栓素、纖溶酶原激活物及抑制物含量變化，血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌活性因子等方面有影響作用。但從子宮內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解途徑研究藥物的效應(yīng)目前尚不完善，本研究觀察宮環(huán)止血片對(duì)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中ＭＭＰ。ｌｍＲＮＡ、ＴＩＭＰ．１ｍＲＮＡ的表達(dá)，進(jìn)一步明確宮環(huán)止血片的治療機(jī)制，為?臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)部分一、實(shí)驗(yàn)材料１．試劑及儀器１．１藥品和試劑培養(yǎng)液：ＲＰＭＩ一１６４０干粉培養(yǎng)基（美國ＨＹｃＬｏＮＥ公司產(chǎn)品，按說明配置，加入適量碳酸氫鈉將ＰＨ值調(diào)至７．４，加青霉素ｌＯＯＵ／ｍｌ、鏈霉素１００１ｘｇ／ｍｌ，過濾除菌
2、后分裝，－２０。Ｃｆｆｔ存）；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院）；胰蛋白酶（Ｔｒｙｐｓｉｎ配成０．２５％濃度，以ｏ．２２Ｄｘｍ微孔濾膜注射器加壓過濾除菌，分裝凍存）；注射用兩性霉素Ｂ（上海先鋒藥業(yè)）、注射用青霉素鈉（四川制藥）、注射用硫酸鏈霉素（華北制藥）、Ｐｏｌｙ－１－ｌｙｓｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ）、ＴＢｓ緩沖液（博士德）、ｏ．１Ｍ磷酸鹽緩沖液（ＰＢＳ緩沖液，武漢博士德）。。１．２主要設(shè)備及器材Ｃ０２孵箱（德國賀利氏Ｈｅｒａｃｅｌｌ）、電子天平ＡＧ２０４型（瑞士）、ＯＰＴＯＮ萬能光學(xué)顯微鏡（西德）、ＨＨ．Ｗ三用恒溫水浴箱、超凈工作臺(tái)（蘇州ＳＷ－ＣＪ．２ＦＤ）、ＳＫＧ．０１電熱恒溫
3、干燥箱、ＴＤＺ５一ＷＳ臺(tái)式多管自動(dòng)平衡離心機(jī)、ＣＲＤＸ。２８０電墊手提式滅菌消毒器、ＰＣＲ擴(kuò)增儀（ＵＳＡ）、５０ｍｌ培養(yǎng)瓶、刻度吸管、試管、離心管、培養(yǎng)皿、９６孔培養(yǎng)板等。１．３檢測(cè)試劑（１）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Ｐｒｏｍｅｇａ公司）。（２）ＴＲＩｚ０１試劑（美國ＧＩＢｃ０公司）。（３）ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２、１０ｘｂｕｆｆｅｒ等ＰＣＲ，反應(yīng)試劑、瓊脂糖ｆ上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司ｏ（４）ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（１００ｂｐｌａｄｄｅｒ）。（５）ＤＥＰｃ（美國ｓｉｇｍａ公司），Ｄ—Ｈａｎｋｓ＇Ｗｋ（美ＧＩＢｃｏ公司），ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｓ－ｂａｓｅ、硼酸（Ｐｒ
4、ｏｍｅ黟公司），氯仿、異丙醇、無水乙醇（國產(chǎn)）。（６）鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶１（ＭＭＰ一１）單克隆抗體（北京中山生物工程有限公司，為美國ＳａｎｔａＣｒｕｚ＆司產(chǎn)品１。（７）鼠抗人金屬蛋白酶組織抑制因子１（ＴＩＭＰ一１）單克隆抗體ｆ北京中山生物工程有限公司，為美／訇ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司產(chǎn)品）。（８）ｓＰ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）免疫組化試劑盒（北京中山生物工程有限公司）。（９）ＤＡＢ顯色試劑盒（武漢博士德）、Ｍａｙｏｒ，蘇－木素（ＳＩＧＭＡ）、０，０１Ｍ枸櫞酸鹽緩沖液、無水乙醇等。２．誘導(dǎo)劑和施加藥物２．１誘導(dǎo)劑：細(xì)菌脂多糖（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａ
5、ｒｉｄｅ，ＬＰＳＳＩＧＭＡ公司０１２７：Ｂ８）溶于ＲＰＭｌｌ６４０（含胎牛血清１０％）的培養(yǎng)液中，用０．２２１ａｍ濾膜加壓過濾除菌，置４。Ｃ過夜備用。２．２施加藥物宮環(huán)止血片浸膏，湖南省藥品研究服務(wù)中心提供，批號(hào)２００１０３０２，吲哚美辛腸溶片，２５ｍｇ／）：｝，鎮(zhèn)江吉貝爾藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。含藥血清的制備：大鼠１２只，全部雌性。隨機(jī)分兩組，分別給以宮環(huán)止血片和吲哚美辛灌胃。灌胃劑量如下：２００９大鼠體表面積Ｓ＝３１１．２ｃｍ２，體表面積系數(shù)為：０．００２４，按每ｋｇｉ９４．Ｏｍｌ。宮環(huán)止血片浸膏每克含９．８９生藥，人每日３．３６６９浸膏。ｌｋｇ大鼠所用劑量＝３．３３６９ｘ
6、０．００２４＋０．２＝０．０４０３９２９／ｄ，由此０．０４０３９２＋４．Ｏｍｌ＝Ｏ．０１００９８９／ｍｌ吲哚美辛２５ｍｇ／片，人所需劑量為７５ｍｇ／ｄ。ｌｋｇ大鼠劑量＝ｏ．０７５ｘ０．００２４＋０．２＝０．０００９每天每埏體重量需Ｏ．０００９９，ｏ．０００９＋４得出，每ｍ１含量為ｏ．０００２２５９。按劑量配制連續(xù)灌胃３ｄ，末次給藥后１ｈ，清醒狀態(tài)下頸動(dòng)脈分離插管采血，同組血清混合經(jīng)Ｏ．２２ｐｍ微孔濾膜過濾后，５６。Ｃ、３０ｍｉｎ水浴滅活處理，一２０。Ｃ保存?zhèn)溆茫郏保薄浚郏保玻薄２煌瑵舛人幬锏呐渲疲簩⒔?jīng)滅活處理后的舍藥血清加入培養(yǎng)液，分別配制成含宮環(huán)止血片２．５％，５％，１０％
7、，２０％，４０％不同濃度的含藥血清；和含吲哚美辛２．５％，５％，１０％，２０％，４０％不同濃度的含藥血清。并設(shè)正常血清對(duì)照組分別含標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清２．５％，５％，１０％，２０％，４０％不同濃度，及無血清空白對(duì)照組，４。Ｃ保存?zhèn)溆谩６?、?shí)驗(yàn)方法１．標(biāo)本來源組織標(biāo)本均來自于湖南省婦幼保健院門診診刮病人，患者年齡２５～４０歲，３個(gè)月內(nèi)未服用任何激素類藥物，如避孕藥、氟滅酸等影響內(nèi)分泌的藥物。刮取臨床肝郁型患者月經(jīng)周期第１天出血１２ｈ內(nèi)的標(biāo)本。全過程均在無菌條件下完成，子宮內(nèi)膜標(biāo)本用滅菌的冷生理鹽水反復(fù)沖洗，除去血
