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1、cDNA文庫組標(biāo)準(zhǔn)流程一.TotalRNA的提取1二.mRNA的分離6三．cDNA雙鏈合成8四．載體制備11五.cDNA雙鏈和載體的連接14六．電轉(zhuǎn)化流程15七．快速鑒定、菌落PCR17八．pBlueScriptcDNA庫擴(kuò)增19一.TotalRNA的提取1.試劑配制準(zhǔn)備工作：1、研缽、5ml/10ml/25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、藥匙、試劑瓶等玻璃制品均用錫紙包裹口部，置于烤箱內(nèi),180℃，烤6小時。2、50ml/1.5ml離心管、槍頭等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡過夜后，121℃20mi
2、ns?高壓滅菌。3、電泳槽及電泳托、梳子用3%雙氧水處理。4、常用試劑及其配方：▲DEPC水：在1000ml去離子水中加入100ulDEPC,靜置過夜后高壓滅菌?！?.78M檸檬酸納：PH=4~5三水合檸檬酸納22.94g加DEPC水定容至100ml，室溫放置備用?！?0%肌氨酸鈉：肌氨酸鈉10g加DEPC水定容至100ml，室溫放置備用?！冃粤呀庖海?.78M檸檬酸鈉8.25ml10%肌氨酸鈉12.375ml異硫氰酸胍118.05g加DEPC水定容至250ml，室溫放置備用臨用前加β-巰基乙醇使其終濃度為1%（v/v）▲2M醋酸鈉PH=
3、4.5NaAc·3H2O13.6g加DEPC水定容至50ml,高壓滅菌，室溫放置備用▲3M醋酸鈉PH=5NaAc·3H2O20.4g加DEPC水定容至50ml,高壓滅菌，室溫放置備用▲4MLiCL:LiCL24.164g加DEPC水定容至100ml,高壓滅菌，室溫放置備用▲0.5MEDTAPH=8.0EDTA18.61g用NaOH調(diào)PH值至8.0，定容到100ml，高壓滅菌，室溫放置備用18▲10XMOPS(3-（N-嗎啉代）丙磺酸):MOPS41.86gNaAC·3H2O4.10g0.5MEDTA（PH8.0）20ml用NaOH調(diào)PH值6
4、.5,DEPC水定容到1L，室溫避光放置備用?！?xMOPS:10xMOPS30ml加DEPC水270ml，用時現(xiàn)配?！?xRNALoadingbuffer:10xMOPS400ul甘油（高壓過）200UL溴酚蘭10ul甲醛(37%)72ul去離子甲酰氨310ulEDTA(0.5MPH8.0)8ulErBr(10mg/mlinDEPCH2O)70ul在4℃可保持3個月▲10xPBSpH=7.4NaCl80gKCl2gNa2HPO414.4gKH2PO42.4g定容至1000ml▲變性電泳膠：稱取0.5g瓊脂糖，加入47.5ml1xMOPs，
5、加熱至瓊脂糖熔化后，冷卻至50℃左右，加入2.5ml甲醛，輕輕混勻后倒入電泳托上?！冃噪娪揪彌_液：在250ml容量瓶內(nèi)加入5ml甲醛，用1xMOPS定容至250ml2.動物組織totalRNA的提取1．根據(jù)表1選擇適當(dāng)?shù)慕M織量和相應(yīng)的變性裂解液量，將變性裂解液分裝到RNase-free的50ml無菌離心管中，冰浴5分鐘。2．將組織樣品放入變性裂解液中，在高速下勻漿15-30秒/次，直到看不見組織和細(xì)胞碎片。3．根據(jù)表1加入適量2M的乙酸鈉（pH4.0），反復(fù)顛倒混勻4-5次。4．根據(jù)表1加入適量酚/氯仿,加蓋顛倒混合4-5次，再搖動10秒
6、鐘。5．冰浴10分鐘。6．4°C，12000g離心20分鐘。7．小心轉(zhuǎn)移上層水相于另一個RNase-free的無菌離心管中，內(nèi)含所需的RNA。蛋白質(zhì)和DNA分別留在了有機(jī)相和中間層。8．加入等體積的異丙醇，-20°C沉淀30分鐘以上。9．4°C，12000g離心20分鐘。10．根據(jù)表1加入適量的變性裂解液重新溶解RNA。11．加等體積的氯仿，加蓋顛倒混合4-5次，再搖動10秒鐘。181．4°C，12000g離心20分鐘。2．小心轉(zhuǎn)移上層水相于另一個RNase-free的無菌離心管中,加入等體積的異丙醇，-20°C沉淀至少30分鐘。3．4°C
7、，12000g離心20分鐘。4．棄上清，加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀。4°C，12000g離心10分鐘。5．棄上清，空氣中干燥RNA沉淀，直至沒有乙醇?xì)馕?。用適量DEPC水充分溶解RNA沉淀。6．取少量RNA用于測定OD值及電泳，其余置－80°C冰箱中保存。表1Mg#oftissue5008001000變性裂解液(ml)58102MNaOACpH4(ml)0.50.81水飽和酚(mL)5810氯仿(mL)11.62異丙醇(mL)468變性裂解液(mL)0.50.81異丙醇(mL)0.50.8175%乙醇(mL)111DEPC-trea
8、tedH20(mL)0.50.813.植物組織totalRNA的提取1.先將研缽于－80℃冰箱中預(yù)冷，然后將1g樣品在液氮中研磨成粉末狀。2.將粉末倒入盛有3ml變性裂解液的50
