DNA和CDNA文庫構(gòu)建

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1、DNA和cDNA文庫的構(gòu)建掌握：基因組文庫構(gòu)建的基本原理和步驟、cDNA文庫構(gòu)建的基本原理和操作技術(shù)；熟悉：cDNA第一鏈的合成、cDNA第二鏈的合成；教學(xué)目的一、基因文庫某一生物部分基因的集合叫該生物的亞基因組文庫。某一生物全部基因的集合叫該生物的基因文庫?；蛭膸欤╣enelibrary)：某個(gè)生物的基因組DNA或cDNA片段與適當(dāng)?shù)妮d體在體外重組后，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并通過一定的選擇機(jī)制篩選后得到大量的陽性菌落（或噬菌體），所有菌落或噬菌體的集合即為該生物的基因文庫。外源DNA片斷、載體、宿主構(gòu)建基因文庫的基本程序：

2、（1）提取研究對象基因組DNA,制備合適大小的DNA片斷，或提取組織或器官的mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，（2）DNA片段或cDNA與經(jīng)特殊處理的載體連接形成重組DNA，（3）重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或體外包裝后浸染受體菌，（4）陽性重組菌落或噬菌斑的選擇?；蛭膸旎蚪MDNA文庫cDNA文庫基因組文庫與cDNA文庫最大的區(qū)別在于cDNA文庫具有時(shí)空特異性。基因文庫的應(yīng)用：構(gòu)建基因文庫的目的：篩選出感興趣的目的基因二、基因組DNA文庫的構(gòu)建（一）基因組DNA文庫的類型質(zhì)粒文庫，（﹤10kb)噬菌體文庫，（0-23kb)粘粒

3、文庫，(~45kb)人工染色體文庫，(又稱大片段基因組DNA文庫，100kb—1Mb）（二）文庫的代表性和隨機(jī)性文庫的代表性：指文庫中所有克隆所攜帶的DNA片段可以覆蓋整個(gè)基因組，也就是說，可以從該文庫中分離任何一段基因組DNA。一個(gè)完整基因組文庫應(yīng)包含克隆的數(shù)目，Clark和Carbon公式：N=ln（1-p）/ln（1-f）N：代表一個(gè)完全基因組文庫所應(yīng)該包含的重組克隆個(gè)數(shù)p：表示所期望的目的基因在文庫中出現(xiàn)的幾率f：表示重組克隆平均插入片段的大小和基因組DNA大小的比值例：哺乳動(dòng)物基因組：3×109Kbp：=99

4、%平均插入片段大小20kbf=20Kb/3×109KbN=ln（1-p）/ln（1-f）=690773.2（三）、基因組DNA文庫的構(gòu)建流程①載體的制備；②高純度大分子量基因組DNA（HighmolecularweightDNA,HMWDNA）的提?。虎跦MWDNA的部分酶切與脈沖電泳分級分離（PFGEsizeselection）；④載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞；⑤重組克隆的挑取和保存?；蚪MDNA文庫的構(gòu)建程序包含5個(gè)部分：1．基因組DNA文庫的載體制備載體的制備要求兩點(diǎn)，一是純度高；二是去磷酸化好。2．

5、高質(zhì)量大分子量基因組DNA的提取和部分酶切構(gòu)建不同大小插入片段的基因組文庫對DNA質(zhì)量要求不同，一般所提取的DNA分子量至少應(yīng)該是文庫最終平均插入片段長度的3～5倍。實(shí)踐表明，提取的基因組DNA分子量越大，所得到的重組克隆的插入片段越大。尋找最適的載體與基因組之間的比例。首先最好選擇轉(zhuǎn)化效率高的進(jìn)口感受態(tài)細(xì)胞或效價(jià)高且質(zhì)量穩(wěn)定的包裝蛋白，對于電轉(zhuǎn)化而言，選擇合適的轉(zhuǎn)化電壓對不同插入片段的DNA的轉(zhuǎn)化效率也有所不同。3．文庫的連接轉(zhuǎn)化或包裝侵染4．文庫的質(zhì)量檢測克隆數(shù)越多，平均插入片段越長，插入效率和基因組覆蓋度越高，文

6、庫質(zhì)量就越好。一般覆蓋倍數(shù)達(dá)到4-6倍覆蓋率。指文庫的對象不是全基因組范圍，而是基因組的某一區(qū)段，如基因組某一特定大小酶切片段的組合，一條染色體或更小的區(qū)段（如一個(gè)YAC或BAC克隆等）。（四）、亞基因組文庫例如：將基因組DNA用多種限制性內(nèi)切酶切割，Southern雜交顯示目標(biāo)基因在8.3kb的Spel片段上則可將Spel酶切的基因組DNA中的8.3kb片斷回收，用于構(gòu)建DNA文庫。三、cDNA文庫的構(gòu)建1、cDNA文庫的特征1）基因表達(dá)的時(shí)空性決定cDNA文庫的取材，構(gòu)建cDNA文庫時(shí)最好選取目的基因表達(dá)量最高的發(fā)

7、育時(shí)期或這一時(shí)期的特殊組織。根葉花花藥莖穗下節(jié)幼胚GAmyb2）表達(dá)量的差異決定構(gòu)建cDNA文庫要具有合適的容量。3)mRNA的豐度高豐度mRNA：5000多個(gè)拷貝，占總mRNA的22%中等豐度mRNA：200-300個(gè)拷貝，占總mRNA的49%低豐度mRNA：1-15個(gè)拷貝，占總mRNA的29%2、均一化cDNA文庫通過一定的策略和方法，將構(gòu)建好的獨(dú)立cDNA文庫進(jìn)行一定處理，降低高豐度和中等豐度基因在cDNA文庫中的比例，從而使高豐度、中等豐度和低豐度基因在文庫中出現(xiàn)的頻率相對一致，這種cDNA文庫稱均一化cDNA

8、文庫。3、cDNA文庫的構(gòu)建第一，細(xì)胞總RNA的提取和mRNA分離；??第二，第一鏈cDNA合成；??第三，第二鏈cDNA合成；??第四，雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)粒或噬菌體載體并導(dǎo)入宿主中繁殖。插1）mRNA的完整性及mRNA的富集通常是根據(jù)28sRNA和18sRNA條帶的亮度判斷RNA的完整性，間接判斷mRNA的完整性。如果電