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1、cDNA文庫構建及EST序列分析陳威、丁立建、黃顯軍、劉振英、毛?；ā⑸瞎偾伸`、朱竹君（按姓氏首字母排列，排名不分先后）組員任務分配陳威：統(tǒng)籌安排、資料收集丁立建：cDNA文庫應用、資料收集黃顯軍：背景簡介劉振英：cDNA文庫構建原理、資料收集毛?；?、上官巧靈、朱竹君：EST序列分析目錄一、背景簡介二、cDNA文庫構建原理三、cDNA文庫的應用四、EST序列分析五、參考文獻cDNA文庫構建及EST序列分析 背景簡介——黃顯軍cDNA基因文庫：某生物某一發(fā)育時期所轉錄的mRNA經(jīng)反轉錄形成的cDN
2、A片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。1.cDNA文庫背景簡介1.1cDNA文庫產(chǎn)生前的技術概況隨著生物及信息技術的迅速發(fā)展，尋找新基因、克隆新基因、進而研究基因的功能已成為功能基因組研究中的一項重要工作。在過去尋找新基因的方法有：a）消減雜交b）mRNA差異顯示c）cDNA的代表性差異顯示分析法d）差異消減展示等方法這些方法在新基因的發(fā)現(xiàn)方面都各有其獨特的優(yōu)勢，可尋找出一些差異表達序列，但這些差異表達序列大部分情況都是不完整的基因。1.2cDNA文庫的產(chǎn)生由于以前技術的缺點，目前，比較可行而
3、且應用較多的方法主要是cDNA文庫的篩選。一方面cDNA文庫只代表一定時期一定條件下正在表達的基因，是整個真核基因組中的少部分序列，因此cDNA克隆的復雜程度比直接從基因組克隆的要小得多。另一方面由于每個cDNA克隆只代表一種mRNA序列，因此在基因克隆過程中出現(xiàn)假陽性的概率比較低。所以cDNA文庫的構建已成為當前分子生物學研究和基因工程操作的基礎。1.3.為什么要構建cDNA文庫？cDNA便于克隆和大量表達，它不像基因組含有內含子而難于表達，因此可以從cDNA文庫中篩選到所需的目的基因，并直接
4、用于該目的基因的表達。1.4.怎么構建cDNA文庫？1.5.cDNA文庫構建后能干什么？1)可保護瀕危珍惜生物資源2)可以提供構建分子標記連鎖圖譜的所用探針3)可以用于分離全長基因進而開展基因功能研究1.6.cDNA文庫的優(yōu)勢及價值1）優(yōu)勢：cDNA在研究具體某類特定細胞中基因組的表達狀態(tài)及表達基因的功能鑒定方面具有特殊的優(yōu)勢。2）價值：在個體發(fā)育、細胞分化、細胞周期調控、細胞衰老和死亡調控等生命現(xiàn)象的研究中具有更為廣泛的應用價值，是研究工作中最常使用到的基因文庫。2.EST序列分析背景簡介克隆
5、全長cDNA序列的傳統(tǒng)途徑：a)噬斑原位雜交的方法b)采用PCR的方法缺點：工作量大、耗時、耗材這些傳統(tǒng)方法已滿足不了人類基因組時代迅猛發(fā)展的要求。2.1.EST序列分析的產(chǎn)生隨著人類基因組計劃的開展，在基因結構、定位、表達和功能研究等方面都積累了大量的數(shù)據(jù)，如何充分利用這些已有的數(shù)據(jù)資源，加速人類基因克隆研究，同時避免重復工作，節(jié)省開支，已成為一個急迫而富有挑戰(zhàn)性的課題擺在我們面前。采用生物信息學方法延伸表達序列標簽（ESTs）序列，獲得基因部分乃至全長cDNAycg，將為基因克隆和表達分析提
6、供空前的動力，并為生物信息學功能的充分發(fā)揮提供廣闊的空間。2.2.EST技術的作用價值EST技術最常見的用途是基因識別，傳統(tǒng)的全基因組測序并不是發(fā)現(xiàn)基因最有效率的方法，這一方法顯得即昂貴又費時。因為基因組中只有2%的序列編碼蛋白質，因此一部分科學家支持首先對基因的轉錄產(chǎn)物進行大規(guī)模測序，即從真正編碼蛋白質的mRNA出發(fā)，構建各種cDNA文庫，并對庫中的克隆進行大規(guī)模測序。Adams等提出的表達序列標簽的概念標志著大規(guī)模cDNA測序時代的到來。雖然ESTs序列數(shù)據(jù)對不精確，精確度最高為97%，但實
7、踐證明EST技術可大大加速新基因的發(fā)現(xiàn)與研究。目錄一、背景簡介二、cDNA文庫構建原理三、cDNA文庫的應用四、EST序列分析五、參考文獻cDNA文庫的構建——劉振英為什么構建cDNA文庫真核生物基因結構原核生物有很大差異。真核生物的基因不能直接在原核生物中表達,只有將加工成熟的mRNA經(jīng)逆轉錄合成互補的DNA（cDNA），并連接相應的原核細胞表達控制元件，才能在原核生物中表達。mRNA的不穩(wěn)定性真核細胞的基因通常只有一小部分進行表達，由于mRNA的不穩(wěn)定性，因而對真核基因的表達和相關的mRNA
8、研究，一般都是通過對cDNA的研究來進行。But如何構建cDNA文庫www.themegallery.comLOGOmRNA的分離制備寡聚胸苷酸〔oligo(dT)〕纖維素或瓊脂糖親和層析法，在高鹽緩沖溶液中poly(A)＋RNA與oligo(dT)結合，低鹽緩沖溶液使它們解離。www.themegallery.comLOGOcDNA第一鏈的合成Oligo（dT）引導的cDNA合成高濃度的Oligo（dT）引物與mRNA的3'末端的poly（A）配對。優(yōu)點：逆轉錄反應基本被限定在以mRNA為模板
