石蠟包埋組織切片mirna提取

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1、石蠟包埋組織切片miRNA提取試劑盒(DP502)操作指南天根生化科技（北京）有限公司版本號(hào)：20170524實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備1.石蠟切片或石蠟塊樣本2.無水乙醇，二甲苯3.移液器及配套R(shí)Nase-Free無菌槍頭（200μl，1ml）；1.5ml，2.0ml離心管（RNase-free）4.渦旋振蕩器，臺(tái)式低溫離心機(jī)，金屬浴/水浴實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備-試劑盒準(zhǔn)備第一次使用前應(yīng)在漂洗液RW中加入無水乙醇，加入量請(qǐng)參見瓶上標(biāo)簽。在加入無水乙醇后在瓶身做好標(biāo)記。Step1使用石蠟切片樣本時(shí)，取切片（5-10μm使用石蠟塊

2、樣本時(shí)，將石蠟樣品切成厚，1×1cm2大?。?-8張，刮取樣本。5-10μm厚的片狀，切2-8片。注意：使用石蠟塊樣本時(shí)，如果樣品表面暴露于空氣中,最初的2~3片棄掉不用。Step2迅速將切片或刮取的樣本置于1.5mlRNase-free的離心管中，加入1ml二甲苯，劇烈渦旋10sec。Step312,000rpm（~13,400×g）室溫離心2min，棄上清。注意：建議用移液槍吸除上清，不要吸到沉淀；不要用傾倒去除上清。Step4在上述管中加入1ml無水乙醇，渦旋混勻10sec。Step5室溫(

3、15-25℃)，12000rpm(~13,400×g)離心2min。用槍頭吸除上清，小心不要吸到沉淀用一個(gè)新的槍頭小心吸出殘余的乙醇。Step6打開管蓋，室溫(15-25℃)或37℃放置10min直至殘余的乙醇揮發(fā)完全。殘余的乙醇會(huì)對(duì)RNA產(chǎn)生影響。Step7加入150μl裂解液RF以及10μlProteinaseK于沉淀中，徹底渦旋混勻。Step855℃孵育15min之后80℃孵育15min。Step9冰上放置3min，12,000rpm(~13,400×g)離心15min，轉(zhuǎn)移上清至新的2ml

4、RNase-Free離心管中。Step10加入16μl的RDD顛倒混勻室溫放置15min和10μl的DNaseIStep11加入320μl緩沖液RB渦旋混勻Step12加入1120μl的無水乙醇渦旋混勻(可能會(huì)出現(xiàn)沉淀)Step13and14轉(zhuǎn)移700μl溶液和沉淀入吸附柱CR3中（吸附柱放在收集管中），12,000rpm(~13,400×g)離心1min，棄掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。Step14重復(fù)步驟13直到所有溶液完全通過吸附柱CR3，棄廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。Ste

5、p15and16向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液室溫靜置2min，室溫12,000rpmRW（請(qǐng)先檢查是否已加入乙醇）(~13,400×g)離心30-60sec，棄廢液。Step16重復(fù)步驟15一次Step17將吸附柱CR3放入2ml收集管中，室溫12,000rpm吸附柱CR3室溫放置2-5min(~13,400×g)離心2min，去除殘余液體。徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實(shí)驗(yàn)。Step18將吸附

6、柱CR3轉(zhuǎn)入一個(gè)新的RNase-Free離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加30-100μlRNase-FreeddH2O，室溫放置2min，12,000rpm(~13,400×g)離心2min。洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于30μl，體積過小影響回收效率。RNA溶液請(qǐng)于-70℃保存，以防降解。