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《實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用RealtimeQuantitativePCR》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用(RealtimeQuantitativePCR)講座提綱實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的幾種方法介紹實時熒光定量PCR醫(yī)學(xué)和科研中的應(yīng)用實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的幾種方法介紹實時熒光定量PCR醫(yī)學(xué)和科研中的應(yīng)用實時熒光定量PCR定義在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法實時熒光定量PCR原理實時原理常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴(kuò)增反應(yīng)實時檢測實時定
2、量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析實時熒光定量PCR原理定量原理介紹三個概念：擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值如何對起始模板定量？通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進(jìn)行定量分析實時熒光定量PCR原理-----------擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線圖：橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強度每個循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號的收集熒光基團(tuán)熒光檢測元件實時熒光定量PCR原理-------熒光閾值熒光信號閾值（threshold）：前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（basel
3、ine），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99真正的信號:熒光信號超過域值實時熒光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定義：PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t)value實時熒光定量PCR原理-------Ct值的重現(xiàn)性橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量Ct值的特點：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點處產(chǎn)物量不恒定；
4、Ct值則極具重現(xiàn)性實時熒光定量PCR原理---------定量原理理想的PCR反應(yīng)：X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)：X=X0(1+Ex)nn：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴(kuò)增效率實時熒光定量PCR原理---------定量原理在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值強度時擴(kuò)增產(chǎn)物的量.在閾值線設(shè)定以后,它是一個常數(shù),我們設(shè)為M方程式(1)兩邊同時取對數(shù)得:logM=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+lo
5、gM(3)Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量實時熒光定量PCR原理---------標(biāo)準(zhǔn)曲線模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量確定未知樣品的C(t)值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量Sample實時熒光定量PCR原理絕對定量25講座提綱實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的幾種方法介紹實時熒光定量PCR實驗設(shè)計及應(yīng)用實時熒光定量P
6、CR原理實時熒光定量PCR的幾種方法介紹實時熒光定量PCR實驗設(shè)計及應(yīng)用非特異性熒光標(biāo)記：1、SYBRGreen特異性熒光標(biāo)記：2、TaqMan3、MolecularBeacon4、Amplisensor實時熒光定量PCR原理---------DNA產(chǎn)物的熒光標(biāo)記QQR實時熒光定量PCR方法1---------SYBRGreen法SYBRGreenSYBRGreen法工作機(jī)理SYBRGreen能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時，DNA雙鏈分開，無熒光復(fù)性和延伸時，形成雙鏈DNA，SYBRGreen發(fā)
7、熒光，在此階段采集熒光信號。SYBRGreen實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲線分析溫度熒光強度TmTm值：DNA解鏈一半時的溫度實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲線分析將溫度與熒光強度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)-dIdTTmSYBRGreen法融解曲線分析融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)
8、雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確非特異性產(chǎn)物CyclenumberFlourescencCk102Ck104SampleCy
