抗菌肽替代抗生素實(shí)驗(yàn)實(shí)施方案

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1、抗菌肽替代抗生素對肉雞生產(chǎn)性能、免疫功能及腸道健康的作用效果試驗(yàn)方案一、研究背景由于飼用抗生素的危害日趨嚴(yán)重，目前允許使用的種類越來越少，歐盟已于去年全面禁止在飼料中添加使用，所以開展抗生素替代物的研究顯得非常重要。本試驗(yàn)以抗菌肽為研究材料，添加到肉雞日糧中，研究不同的添加量對肉雞的生長、消化和免疫系統(tǒng)的影響，并通過腸絨毛結(jié)構(gòu)的觀察及免疫指標(biāo)的檢測，探索抗菌肽增強(qiáng)肉雞生產(chǎn)功能的機(jī)理，旨在確定應(yīng)用抗菌肽替代飼用抗生素的可行性，為抗菌肽制劑在肉雞生產(chǎn)中推廣利用提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。二、試驗(yàn)設(shè)計(jì)本試驗(yàn)采用單因子完全隨機(jī)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將90

2、0（或720）只AA肉雞隨機(jī)分成6個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25（20）只雞，試驗(yàn)期為6周。試驗(yàn)材料：富力泰C（海納川藥業(yè)的抗菌肽）、抗菌肽D對照組（國內(nèi)某企業(yè)生產(chǎn)的抗菌肽）、恩拉鼎F-40（先靈葆雅的恩拉霉素）。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。表1試驗(yàn)設(shè)計(jì)組別處理A空白對照組（日糧不添加任何抗生素）B富力泰C1組（空白對照組日糧+50mg/kg抗菌肽）C富力泰C2組（空白對照組日糧+100mg/kg抗菌肽）D富力泰C3組（空白對照組日糧+150mg/kg抗菌肽）E抗生素對照組（日糧+200mg/kg恩拉鼎F-40組,4ppm

3、,不休藥）F抗菌肽D對照組（日糧+200mg/kg肽生素）三、測定指標(biāo)1.生產(chǎn)性能在試驗(yàn)的第21d和42d，每個(gè)重復(fù)的雞空腹稱重，記錄前后兩期（1-21d，22-42d）每個(gè)重復(fù)雞的體重和采食量，統(tǒng)計(jì)計(jì)算平均日采食量、平均日增重和料重比。平均日采食量（ADFI）=總耗料量/飼養(yǎng)日平均日增重（ADG）=（試驗(yàn)?zāi)w重-起始體重）/試驗(yàn)天數(shù)料重比（F/G）=總耗料/總增重試驗(yàn)雞每周統(tǒng)計(jì)一次耗料。2.免疫功能1）免疫器官指數(shù)測定試驗(yàn)第21d和42d，從個(gè)每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取2只雞，稱重后宰殺，解剖剝離或摘取胸腺、脾臟、法氏囊，稱取各免

4、疫器官重量。免疫器官指數(shù)計(jì)算公式：脾臟指數(shù)=脾臟重量（g）/雞體重（kg）胸腺指數(shù)=胸腺重量（g）/雞體重（kg）法氏囊指數(shù)=法氏囊重量（g）/雞體重（kg）2）血清生化指標(biāo)試驗(yàn)第21d和42d，從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取2只雞，翅靜脈采血，離心分離血清，用免疫透射比濁法試劑盒，測定血清中血清白蛋白、IgG、IgM以及補(bǔ)體C3、C4含量。同時(shí)用免疫比濁法試劑盒測定血清中的溶菌酶。3.腸道健康的影響1）腸道食糜消化酶活性樣品采集和處理：21d和42d，從個(gè)每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取2只雞，宰殺，取小腸食糜。食糜用4℃的0.4mol/L氯化鈉溶

5、液稀釋10倍，勻漿。將勻漿液4℃下1200rpm離心5min，將上清液置于﹣20℃保存?zhèn)錅y。測定淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等活性，采用南京建成生物有限公司試劑盒。2）腸道內(nèi)容物菌群測定試驗(yàn)第21d和42d，從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取2只雞，宰殺，無菌取回盲交接處回腸、盲腸段，兩端結(jié)扎，無菌操作臺內(nèi)稱取0.5g左右腸段內(nèi)容物于滅菌稀釋瓶內(nèi)，加入先配好已滅菌的生理鹽水4—10倍稀釋，將回盲腸內(nèi)容物稀釋液10ul分別接種于麥康凱培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基，培養(yǎng)腸道內(nèi)大腸桿菌、乳酸桿菌。細(xì)菌數(shù)量統(tǒng)計(jì)：根據(jù)菌落可數(shù)性原則，選擇合適稀釋度，用血球計(jì)數(shù)

6、板統(tǒng)計(jì)菌落個(gè)數(shù)，換算出每克腸道內(nèi)容物中所含有的細(xì)菌數(shù)，并以其對數(shù)值表示（lgN/g）。1）小腸絨毛長度及隱窩深度比值試驗(yàn)第21d和42d，從個(gè)每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取2只雞，宰殺，取空腸（卵黃囊遺跡之上5cm）腸管約2cm，用10%甲醛磷酸緩沖液固定，做石蠟切片，HE染色，顯微鏡觀察。1.殘留檢測42d殺雞，取肌肉及肝臟樣，檢測肌肉樣及肝臟恩拉霉素殘留，將每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取的2只雞的樣品合并檢測，加上空白對照共：3組*6重復(fù)*2肌肉及肝臟樣=36個(gè)樣。對于抗菌肽組，檢測高、中、低及空白對照組的肌肉、肝臟、糞便中的抗菌肽基因。共4組*

7、6重復(fù)*3=72個(gè)樣。具體的引物設(shè)計(jì)請參考“轉(zhuǎn)柞蠶抗菌肽CAD基因畢赤酵母GS115.CAD-1在廣東省環(huán)境釋放”。5.經(jīng)濟(jì)效益分析4%的恩拉鼎F-40價(jià)格為120元/千克，富力泰C成本約120元/千克，肽生素成本約80元/千克。根據(jù)生長性能指標(biāo)評估成本。體外試驗(yàn)1、產(chǎn)品評價(jià)檢測富力泰、肽生素的藥物殘留（即產(chǎn)品是否摻有抗生素）這部分費(fèi)用沒有計(jì)算在總經(jīng)費(fèi)里。2、體外抑菌試驗(yàn)采用瓊脂打孔法對恩拉鼎F-40、富力泰C、肽生素進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)。以大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌為病原指示菌，測以上三種產(chǎn)品的MIC值

8、。以富力泰C對大腸桿菌的MIC檢定為例，方法如下：1.試劑：液體LB培養(yǎng)基配制胰蛋白胨：1%OXOID牌TRYPTONE酵母浸粉：0.5%OXOID牌YEASTEXTRACTNaCl:1%技術(shù)瓊脂粉（進(jìn)口）：1.2～1.5%廣東環(huán)凱微生物科技有限公司將上述培養(yǎng)基配比，以水為溶劑，調(diào)pH值7.0，滅菌備用