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《its菌種鑒定方 法》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、利用ITS進(jìn)行菌種鑒定是目前較多采用的方法。ITS是內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(InternallyTranscribedSpacer)的英文縮寫,位于rRNA編碼基因18S,5.8S和28S之間的小基因片段。其優(yōu)點(diǎn)有:具有高拷貝數(shù),整個(gè)序列的長(zhǎng)度在600～800bp，利用rDNA通用引物能夠很容易被擴(kuò)增出來；同時(shí)包含保守與變異序列,能根據(jù)保守序列中的變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特殊引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增比較，rRNA基因(rDNA)在微生物的鑒定應(yīng)用中，具有檢測(cè)微生物種水平的多態(tài)性特征。這些rDNA高度保守地分布在染色體的不同位置，在每個(gè)單倍染色體基因組中的拷貝數(shù)超過200個(gè),這使得
2、保守區(qū)域能夠很容易被擴(kuò)增出來。每個(gè)重復(fù)的rDNA序列的存在方式為由一前一后的18SrDNA小亞基單元(SSU),5.8SrDNA,28SrDNA大亞基單元(LSU)組成,已設(shè)計(jì)出通用引物來擴(kuò)增ITS序列分析相關(guān)真菌種水平之間的差異。本研究通過絲狀真菌ITS保守序列的擴(kuò)增,同源序列的對(duì)比分析,結(jié)合傳統(tǒng)鑒定方法,對(duì)從土壤中分離篩選的一株絲狀真菌進(jìn)行了分析鑒定,并對(duì)鑒定結(jié)果和方法進(jìn)行了比較分析。種內(nèi)變異還顯示在rDNA基因間內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)Ⅰ和Ⅱ（分別為ITSⅠ和ITSⅡ）的片段大小上。ITS區(qū)在核糖DNA中進(jìn)化較快，可在同一屬間甚至群體間發(fā)生變化。其中ITSⅡ區(qū)
3、在種間變異性較高（22％），種內(nèi)變異性較低（＜3％）。選擇的兩對(duì)引物均以ITS區(qū)的序列為靶目標(biāo)，其中引物①（ITS1和ITS4）擴(kuò)增的是ITSⅠ區(qū)、5.8SrDNA和ITSⅡ區(qū)的基因序列，可以鑒別出念珠菌屬的3個(gè)菌種；引物②（ITS4和ITS86）擴(kuò)增的是5.8SrDNA和28SrDNA之間的ITSⅡ區(qū)的保守順序，可以鑒別出念珠菌屬的7個(gè)菌種。因而筆者更推薦采用引物②，它不僅有很強(qiáng)的通用性，能識(shí)別更多菌種，而且具有更高的屬種特異性。1、通用引物①：ITS15'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG一3’ITS45'-TCCTCCGCTTATTGATAT
4、GC一3’通用引物②ITS45'-TCCTCCGCTTATTGATATGC一3’ITS865'-GTGAATCATCGAATCTTTGAAC一3’
