rDNA-ITS擴增法鑒定真菌種類

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1、《生化實驗技術(shù)與應(yīng)用》實驗設(shè)計方案實驗項目:rDNA-ITS擴增法鑒定真菌種類班級：102日期：201231一.實驗?zāi)康?(1)學(xué)習(xí)和掌握提取核酸的原理和技術(shù)。(2)掌握真菌基因組DNA提取的方法及操作過程。(3)學(xué)習(xí)DNA瓊脂糖凝膠電泳及DNA純度、濃度、分了大小的測定方法。(4)學(xué)習(xí)PCR鑒定技術(shù)的原理和操作。(5)初步了解自主設(shè)計實驗的思路，為以后的畢業(yè)論文設(shè)計打下基礎(chǔ)。二、實驗原理:(-)基因組DNA的提取真菌是真核生物，細(xì)胞膜外有細(xì)胞壁，我們使用液氮研磨法裂解細(xì)胞，去壁后用SDS溶液處理

2、。真核生物的DNA與組蛋白結(jié)合形成DNP,SDS能夠破壞DNA與蛋白質(zhì)之間的靜電引力或配位鍵，可使DNA與蛋口質(zhì)解聚，釋放出DNA。再用苯酚/氯仿/異戊醇抽提法去除蛋白質(zhì)，所得上清用異戊醇沉淀獲得DNA。用RNA酶處理去除RNA,最后收獲純度較高的基因組DNAoo(二)DNA含量測定：紫外分光光度法核酸、核甘酸及其衍生物都具有共軌雙鍵，具有紫外吸收。RNA和DNA的紫外吸收峰為260nmo一般在260nm波長下,在pH7.0時每毫升含lugDNA溶液的光吸收值約為0.020,每毫升含lugRNA溶

3、液的光吸收值為0.022-0.024。故則定待測濃度DNA溶液260nm的光吸收值即可計算出其屮核酸的含量。(三)DNA純度測定：紫外分光光度法核酸、核昔酸及其衍牛物都具有共呃雙鍵，具有紫外吸收。RNA和DNA的紫外吸收峰為260nmo一核酸樣品內(nèi)混雜有大量的核甘酸或蛋白質(zhì)等蛋白質(zhì)由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白質(zhì)的吸收高峰在280nni處。故測定出A260與A280的比值可以間接說明DNA液的純度。純凈的DNA溶液，其A260/A280^1.8o（四）DNA分子大小測定：瓊脂糖凝

4、膠電泳電泳（electrophoresis）是荷電溶質(zhì)或粒子在電場作用下發(fā)生定向泳動的現(xiàn)象。核酸的分離和鑒定通常采用瓊脂糖凝膠電泳。不同大小、不同形狀和不同構(gòu)象的DNA分子在相同的電泳條件下（如凝膠濃度、電流、電壓、緩沖液等），有不同的遷移率，所以可通過電泳使其分離。瓊脂糖凝膠電泳分離后的DNA可用澳化乙噪（EB）染色，在254im波長紫外光照射下，呈現(xiàn)橙黃色的熒光。（五）PCR鑒定技術(shù)真核生物基因組中編碼核糖體的基因包括28SrDNA,5SrDNA,18SrDNA和5.8S4種，他們在染色體上頭

5、尾相連，串聯(lián)排列，相互間由間隔區(qū)分隔。其中18S,5.8S,和28SrDNA基因組成一個轉(zhuǎn)錄單元（圖1）,三者高度保守，適合于較高等級水平的生物群體間的系統(tǒng)分析，其間的間隔區(qū)為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（InternalTranscribedSpacer,ITS）,包括ITS1和ITS2兩部分,由于進化相對迅速而具有多態(tài)性，因而適合等級水平較低的系統(tǒng)學(xué)研究。ITS1primerITS2primerITS3primerITS4primer圖1真菌rDNA轉(zhuǎn)錄區(qū)和相關(guān)引物我們選擇分別選擇ITS1、ITS2和ITS3

6、、ITS4兩對引物進行PCR來鑒定真菌的種類。分別單獨分析ITS1區(qū)，ITS2

7、x序列來研究親緣關(guān)系較近的屬種或群組Z間小范I韋I和低水平的序列變化。三.實驗儀器:紫外分光光度計，水平板型電泳槽，制膠板一套，穩(wěn)壓電泳儀，微量移液槍,凝膠成像分析系統(tǒng)，高速離心機，電子天平，微波爐，恒溫水浴鍋，PCR儀。5ml離心管，l?5ml無菌離心管，無菌吸頭，吸水紙，移液管，錐形瓶，一次性手套等。四.材料與試劑(請寫明具體配制方法及使用的量):(―)DNA提取(1)真菌樣品，由老師提供。(1)液氮。(2)TE緩

8、沖液(pH7.5)：10mmol/LTris-HCl,pH7.5,lmmol/LEDTA(pH8.0),121°C高壓滅菌20min,#fl具中l(wèi)nnnol/LEDTA(pH8.0)：稱取121.1gEDTA

9、1Omg/mlRNaseA溶液10uLo(-)DNA含量及純度測定(1)標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液：取標(biāo)準(zhǔn)DNA以0.01mol/L氫氧化鈉溶液配成100ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。(三)瓊脂糖凝膠電泳(1)Tris-硼酸-EDTA緩沖液(TBE緩沖液)，pH8.3：稱取10.78gTris,5.50g硼酸,0.93gEDTA-Na2溶于去離子水，定容至lOOOmLo(2)瓊脂糖。(3)0.05%澳酚藍-50%甘油溶液(5XLoadingBuffer):取一定量的0.1%澳酚藍水溶液，與等休積甘汕混合