基因結(jié)構(gòu)與功能分析ppt培訓課件

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1、第二十二章基因結(jié)構(gòu)與功能分析技術(shù)TheAnalysisTechnologyforGeneStructureandFunction李冬民博士副教授Email：lidm518@163.com西安交通大學醫(yī)學部生物化學與分子生物學系人類的多種疾病都與基因的結(jié)構(gòu)或功能異常有關(guān)，因此，要闡明疾病發(fā)生的分子機制和進行有效的診斷與防治，均需首先揭示基因的結(jié)構(gòu)與功能。DNA序列測定基因轉(zhuǎn)錄起點及其啟動子的分析基因編碼序列的分析基因拷貝數(shù)及其表達產(chǎn)物的分析基因功能獲得和/或缺失策略隨機突變篩選策略第一節(jié)基因結(jié)構(gòu)分析技術(shù)一、基因一級結(jié)構(gòu)解析技術(shù)基因

2、的一級結(jié)構(gòu)是指脫氧核苷酸的排列順序，解析一級結(jié)構(gòu)最精確的技術(shù)就是DNA測序（DNAsequencing）。（一）雙脫氧法和化學降解法是兩種常規(guī)的DNA測序方法Sanger雙脫氧測序（dideoxysequencing）法Maxam-Gilbert化學降解測序法Maxam-Gilbert化學降解測序法圖硫酸二甲酯和六氫吡啶在鳥嘌呤殘基位點切割DNA的化學過程Maxam-Gilbert化學降解測序法圖聯(lián)氨和六氫吡啶在胸腺嘧啶殘基位點切割DNA的化學過程Maxam-Gilbert化學降解測序法（二）全自動激光熒光DNA測序技術(shù)的原理基

3、于Sanger雙脫氧法1.四色熒光法：采用四種不同的熒光染料標記同一引物或4種不同的終止底物ddNTP，最終結(jié)果均相當于賦予DNA片段4種不同的顏色。因此，一個樣品的4個反應產(chǎn)物可在同一個泳道內(nèi)電泳。（二）全自動激光熒光DNA測序技術(shù)的原理基于Sanger雙脫氧法2.單色熒光法：采用單一熒光染料標記引物5′-端或dNTP，所有產(chǎn)物的5′-末端均帶上了同一種熒光標記，一個樣品的四個反應必須分別進行，相應產(chǎn)物也必須在四個不同的泳道內(nèi)電泳。（三）焦磷酸測序是一種基于發(fā)光法測定焦磷酸的測序技術(shù)焦磷酸測序技術(shù)操作簡單，結(jié)果準確可靠，可應用

4、于單核苷酸多態(tài)性位點（SNP）分析、等位基因頻率測定、細菌和病毒等微生物的分型鑒定、CpG甲基化分析、掃描與疾病相關(guān)基因序列中的突變點等領(lǐng)域。該方法的測序長度一般短于Sanger法。*APS：5’-磷酸化硫酸腺苷*ATP硫酸化酶：三磷酸腺苷硫酸化酶（四）循環(huán)芯片測序被稱為第二代測序技術(shù)循環(huán)芯片測序（cyclic-arraysequencing）：該方法采用了大規(guī)模矩陣結(jié)構(gòu)的芯片分析技術(shù)，陣列上的DNA樣本可以被同時并列分析。①可實現(xiàn)大規(guī)模并行化分析②不需電泳，設(shè)備易于微型化③樣本和試劑的消耗量降低，降低了測序成本優(yōu)勢：技術(shù)平臺：

5、454測序、Solexa測序（Illumina測序）、SOLiD測序等?；玖鞒蹋孩賹⒒蚪MDNA隨機切割成為小片段DNA；②在所獲小片段DNA分子的末端連上接頭，然后變性得到單鏈模板文庫；③將帶接頭的單鏈小片段DNA文庫固定于固體表面；④對固定片段進行克隆擴增，從而制成polony芯片。⑤針對芯片上的DNA，利用聚合酶或連接酶進行一系列循環(huán)反應，通過讀取堿基連接到DNA鏈過程中釋放出的光學信號而間接確定堿基序列。（五）單分子測序技術(shù)被稱為第三代測序技術(shù)主要策略：①通過摻入并檢測熒光標記的核苷酸，來實現(xiàn)單分子測序，如單分子實時技

6、術(shù)（singlemoleculerealtimetechnology，SMRT）；②利用DNA聚合酶在DNA合成時的天然化學方式來實現(xiàn)單分子測序；③直接讀取單分子DNA序列信息。如非光學顯微鏡成像測序技術(shù)、納米孔測序技術(shù)等。單分子實時技術(shù)（singlemoleculerealtimetechnology，SMRT）二、基因轉(zhuǎn)錄起點分析技術(shù)轉(zhuǎn)錄起點（transcriptionstartsite，TSS）（一）用cDNA克隆直接測序法鑒定TSS以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，同時利用逆轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在cDNA

7、第一鏈的末端加上polyC尾，并以此引導合成cDNA第二鏈。將雙鏈cDNA克隆于適宜載體，通過對克隆cDNA的5?-末端進行測序分析即可確定基因的TSS序列。該方法比較簡單，尤其適于對特定基因TSS的分析。但可導致5?-末端部分缺失，從而影響對TSS的序列測定。（二）用5?-cDNA末端快速擴增技術(shù)鑒定TSS（5?-rapidamplificationofcDNAend，5?-RAGE）常用的技術(shù)包括5?-末端基因表達系列分析（5?-endserialanalysisofgeneexpression，5?-SAGE）和帽分析基因

8、表達（capanalysisgeneexpression，CAGE）技術(shù)。CIAP：堿性磷酸酶TAP：煙草酸焦磷酸酶T4RNA連接酶（三）用數(shù)據(jù)庫搜索TSS利用對寡核苷酸帽法構(gòu)建的全長cDNA文庫5?-末端測序所得的數(shù)據(jù)信息建立了一個TSS數(shù)據(jù)庫（databas