基因結(jié)構(gòu)與功能分析1

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1、生物化學(xué)與分子生物學(xué)第二十二章基因結(jié)構(gòu)與功能分析技術(shù)TheAnalysisTechnologyforGeneStructureandFunction人類(lèi)的多種疾病都與基因的結(jié)構(gòu)或功能異常有關(guān)，因此，要闡明疾病發(fā)生的分子機(jī)制和進(jìn)行有效的診斷與防治，均需首先揭示基因的結(jié)構(gòu)與功能。DNA序列測(cè)定基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)及其啟動(dòng)子的分析基因編碼序列的分析基因拷貝數(shù)及其表達(dá)產(chǎn)物的分析基因功能獲得和/或缺失策略隨機(jī)突變篩選策略第一節(jié)基因結(jié)構(gòu)分析技術(shù)一、基因一級(jí)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指脫氧核苷酸的排列順序，解析一級(jí)結(jié)構(gòu)最精確的

2、技術(shù)就是DNA測(cè)序（DNAsequencing）。（一）雙脫氧法和化學(xué)降解法是兩種常規(guī)的DNA測(cè)序方法Sanger雙脫氧測(cè)序（dideoxysequencing）法Maxam-Gilbert化學(xué)降解測(cè)序法（二）全自動(dòng)激光熒光DNA測(cè)序技術(shù)的原理基于Sanger雙脫氧法1.四色熒光法：采用四種不同的熒光染料標(biāo)記同一引物或4種不同的終止底物ddNTP，最終結(jié)果均相當(dāng)于賦予DNA片段4種不同的顏色。因此，一個(gè)樣品的4個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物可在同一個(gè)泳道內(nèi)電泳。2.單色熒光法：采用單一熒光染料標(biāo)記引物5′-端或dNTP，所有產(chǎn)

3、物的5′-末端均帶上了同一種熒光標(biāo)記，一個(gè)樣品的四個(gè)反應(yīng)必須分別進(jìn)行，相應(yīng)產(chǎn)物也必須在四個(gè)不同的泳道內(nèi)電泳（三）焦磷酸測(cè)序是一種基于發(fā)光法測(cè)定焦磷酸的測(cè)序技術(shù)焦磷酸測(cè)序技術(shù)操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）分析、等位基因頻率測(cè)定、細(xì)菌和病毒等微生物的分型鑒定、CpG甲基化分析、掃描與疾病相關(guān)基因序列中的突變點(diǎn)等領(lǐng)域。該方法的測(cè)序長(zhǎng)度一般短于Sanger法。（四）循環(huán)芯片測(cè)序被稱(chēng)為第二代測(cè)序技術(shù)循環(huán)芯片測(cè)序（cyclic-arraysequencing）①可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模并行化分析②不需

4、電泳，設(shè)備易于微型化③樣本和試劑的消耗量降低，降低了測(cè)序成本優(yōu)勢(shì)：技術(shù)平臺(tái)：454測(cè)序、Solexa測(cè)序（Illumina測(cè)序）、SOLiD測(cè)序等?；玖鞒蹋孩賹⒒蚪MDNA隨機(jī)切割成為小片段DNA；②在所獲小片段DNA分子的末端連上接頭，然后變性得到單鏈模板文庫(kù)；③將帶接頭的單鏈小片段DNA文庫(kù)固定于固體表面；④對(duì)固定片段進(jìn)行克隆擴(kuò)增，從而制成polony芯片。⑤針對(duì)芯片上的DNA，利用聚合酶或連接酶進(jìn)行一系列循環(huán)反應(yīng)，通過(guò)讀取堿基連接到DNA鏈過(guò)程中釋放出的光學(xué)信號(hào)而間接確定堿基序列。（五）單分子測(cè)序技

5、術(shù)被稱(chēng)為第三代測(cè)序技術(shù)主要策略：①通過(guò)摻入并檢測(cè)熒光標(biāo)記的核苷酸，來(lái)實(shí)現(xiàn)單分子測(cè)序，如單分子實(shí)時(shí)技術(shù)（singlemoleculerealtimetechnology，SMRT）；②利用DNA聚合酶在DNA合成時(shí)的天然化學(xué)方式來(lái)實(shí)現(xiàn)單分子測(cè)序；③直接讀取單分子DNA序列信息。二、基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)分析技術(shù)轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)（transcriptionstartsite，TSS）（一）用cDNA克隆直接測(cè)序法鑒定TSS以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，同時(shí)利用逆轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在cDNA第一鏈的末端加上p

6、olyC尾，并以此引導(dǎo)合成cDNA第二鏈。將雙鏈cDNA克隆于適宜載體，通過(guò)對(duì)克隆cDNA的5?-末端進(jìn)行測(cè)序分析即可確定基因的TSS序列。該方法比較簡(jiǎn)單，尤其適于對(duì)特定基因TSS的分析。但可導(dǎo)致5?-末端部分缺失，從而影響對(duì)TSS的序列測(cè)定。（二）用5?-cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)鑒定TSS常用的技術(shù)包括5?-末端基因表達(dá)系列分析（5?-endserialanalysisofgeneexpression，5?-SAGE）和帽分析基因表達(dá)（capanalysisgeneexpression，CAGE）技術(shù)。（

7、三）用數(shù)據(jù)庫(kù)搜索TSS利用對(duì)寡核苷酸帽法構(gòu)建的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)5?-末端測(cè)序所得的數(shù)據(jù)信息建立了一個(gè)TSS數(shù)據(jù)庫(kù)（databaseoftranscriptionstartsites，DBTSS），并在此基礎(chǔ)上，通過(guò)將寡核苷酸帽法和大量平行測(cè)序技術(shù)相結(jié)合開(kāi)發(fā)了一種TSS測(cè)序法，從而實(shí)現(xiàn)了一次測(cè)試可產(chǎn)生1×107個(gè)TSS的數(shù)據(jù)。三、基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析技術(shù)（一）用PCR結(jié)合測(cè)序技術(shù)分析啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)該方法最為簡(jiǎn)單和直接，即根據(jù)基因的啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，然后以PCR法擴(kuò)增啟動(dòng)子，經(jīng)測(cè)序分析啟動(dòng)子序列結(jié)構(gòu)。（二）用

8、核酸-蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)分析啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)1.用足跡法分析啟動(dòng)子中潛在的調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(diǎn)足跡法（footprinting）是利用DNA電泳條帶連續(xù)性中斷的圖譜特點(diǎn)判斷與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA區(qū)域，它是研究核酸-蛋白質(zhì)相互作用的方法，而不是專(zhuān)門(mén)用于研究啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的方法。分類(lèi)：酶足跡法化學(xué)足跡法（1）用核酸酶進(jìn)行足跡分析酶足跡法（enzymaticfootprinting）是利用DNA酶處理DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后通過(guò)電泳