質(zhì)譜分析蛋白的原理與方法淺述

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1、質(zhì)譜分析蛋白的原理與方法淺述摘要：隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，利用質(zhì)譜法進行蛋白質(zhì)分析愈來愈廣泛和深入。本文簡要闡述蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的原理和方法。關(guān)鍵字：蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析原理與方法1概述質(zhì)譜技術(shù)具有較好的靈敏度、準(zhǔn)確度，能準(zhǔn)確測定蛋白質(zhì)。目前質(zhì)譜主要測定蛋自質(zhì)一級結(jié)構(gòu)包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數(shù)目和位置，在對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的研究中占據(jù)了重要的地位。[1,2]質(zhì)譜有進樣器、離子源、質(zhì)量分析器、離子檢測器、控制電腦及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)等組成。傳統(tǒng)的質(zhì)譜僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的分析，但隨著新的離子化技術(shù)的出現(xiàn)，如

2、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）和電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）等，各種質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)為蛋白質(zhì)分析提供了一種新的且準(zhǔn)確快速的途徑。目前，酶解、液相色譜分離、串聯(lián)質(zhì)譜及計算機算法的聯(lián)合應(yīng)用已成為鑒定蛋白質(zhì)的發(fā)展趨勢。2質(zhì)譜分析蛋白的原理：質(zhì)譜法分析蛋白的基本原理是通過電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場、磁場將具有特定質(zhì)量與電荷比值（M/Z）的蛋白質(zhì)離子分離開來，經(jīng)過離子檢測器收集分離的離子，確定離子的M/Z值，分析鑒定未知蛋白。通常結(jié)合相應(yīng)的處理及其他技術(shù)，能夠比較

3、準(zhǔn)確、快速地鑒定蛋白質(zhì)。2.1基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）簡而言之，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜是將多肽成分轉(zhuǎn)換成離子信號，并依據(jù)質(zhì)量/電荷之比（M/Z）來對該多肽進行分析，以判斷該多肽源自哪一個蛋白?；|(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)（MALDI）的基本原理是將分析物分散在基質(zhì)分子中并形成晶體，當(dāng)用激光照射晶體時，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，致使基質(zhì)和分析物膨脹并進入氣相。MALDI所產(chǎn)生的質(zhì)譜圖多為單電荷離子，因而質(zhì)譜圖中的離子與多

4、肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量有一一對應(yīng)關(guān)系。MALDI產(chǎn)生的離子常用飛行時間（TOF）檢測器來檢測，理論上講，只要飛行管的長度足夠，TOF檢測器可檢測分子的質(zhì)量數(shù)是沒有上限的，因此MALDI-TOF質(zhì)譜很適合對蛋白質(zhì)、多肽等生物大分子的研究。[4,7]2.2電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）是在毛細管的出口處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進

5、入氣相。電噴霧離子化的特點是產(chǎn)生高電荷離子而不是碎片離子，使質(zhì)量電荷比降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可以檢測的范圍，因而大大擴展了分子量的分析范圍，離子的真實分子質(zhì)量也可以根據(jù)質(zhì)荷比及電荷數(shù)算出。電噴霧質(zhì)譜的優(yōu)勢就是它可以方便地與多種分離技術(shù)聯(lián)合使用，如液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）是將液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合而達到檢測大分子物質(zhì)的目的。2.3快原子轟擊質(zhì)譜技術(shù)快原子轟擊質(zhì)譜技術(shù)（FABMS）是一種軟電離技術(shù)，是用快速惰性原子射擊存在于底物中的樣品，使樣品離子濺出進入分析器，這種軟電離技術(shù)適于極性強、熱不穩(wěn)定的化合物的分析，特加

6、適用于多肽和蛋白質(zhì)等的分析研究。FABMS只能提供有關(guān)離子的精確質(zhì)量，從而可以確定樣品的元素組成和分子式。而FABMSMS串聯(lián)技術(shù)的應(yīng)用可以提供樣品較為詳細的分子結(jié)構(gòu)信息。3質(zhì)譜分析蛋白的方法：用于質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)的方法主要有三種：肽質(zhì)量指紋圖譜法（PMF）、串聯(lián)質(zhì)譜法（CID）和梯形肽片段測序法（ladderpeptidesequencing）。3.1肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）即用特異性的酶解或化學(xué)水解的方法將蛋白質(zhì)切成小的片段，然后用質(zhì)譜檢測各產(chǎn)物肽的相對分子質(zhì)量，將所得的蛋白酶解肽段質(zhì)

7、量數(shù)在相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫中檢索，尋找相似肽指紋譜，從而繪制“肽圖”。由此可見，分子質(zhì)量的精確度是PMF的關(guān)鍵指標(biāo)所在，但蛋白質(zhì)的翻譯后修飾可能使PMF的質(zhì)量數(shù)與理論值不符，故這就需要與序列信息適當(dāng)結(jié)合。3.2串聯(lián)質(zhì)譜法（CID）串聯(lián)質(zhì)譜法（CID）是利用待測分子在電離及飛行過程中產(chǎn)生的亞穩(wěn)定離子，通過分析相鄰?fù)M類型峰的質(zhì)量差，識別相應(yīng)的氨基酸殘基。串聯(lián)質(zhì)譜的肽序列圖需要讀出部分氨基酸序列與前后的離子質(zhì)量和肽段母質(zhì)量相結(jié)合，這種鑒定方法稱為肽序列標(biāo)簽（PST）。3.3梯形肽片段測序法（ladderpeptideseq

8、uencing）梯形肽片段測序法（ladderpeptidesequencing），與Edman法有相似之處，是用化學(xué)探針或酶解使蛋白或肽從N端或C端逐一降解下氨基酸殘基，產(chǎn)生包含僅異于1個氨基酸殘基質(zhì)量的系列肽，名為ladder，經(jīng)質(zhì)譜檢測，由相鄰肽峰的質(zhì)量差而得知相應(yīng)氨基酸殘基。其中的問題是由于酶解速度不一，易受干擾。4.蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析中的問題4.1蛋白質(zhì)消化蛋白消化蛋白的基團越大