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《western blotting protocol-中山大學(參考)》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、WesternBlotingWesternBloting(張雪雁)操作步驟：1.做膠：下層膠7.5ml一塊，以水或乙醇隔離空氣。待下層膠凝固后做上層膠，每塊膠配置3ml，灌膠、插梳子，趕走氣泡。2.蛋白變性：在膠凝固過程中，變性蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的上樣量按事先所測弄濃度計算準確，分裝到EP管或，按5ul/100ul樣品的濃度加β—巰基乙醇，然后以PCR儀95℃變性10分鐘。3.上樣、電泳：1）上層膠為安全凝固（大約15分鐘）后，兩只手同時向上用力取下梳子。以蒸餾水仔細清洗各泳道內(nèi)殘留得碎膠。2）將SDS—PAGE膠轉(zhuǎn)移到電泳槽中，如果只做一塊膠，對面以玻璃板平衡。1х電
2、泳緩沖液充滿電泳槽后，以玻璃棒將電泳槽中的氣泡盡量趕除。3）先以少量加有溴酚藍1х上樣緩沖液標記各泳道。4）變性過的各管蛋白質(zhì)樣品以加有溴酚藍1х上樣緩沖液補齊至50ul。蛋白Marker也補齊至50ul。5）以一定順序?qū)⒌鞍讟悠泛蚆arker，用微量移液器加至泳道。上樣過程中，手要穩(wěn)，避免將泳道劃破，樣品自槍頭打出時要緩慢，以免樣品自泳道飄出。剩余未加樣的泳道以50ul上樣緩沖液平衡。6）加樣完畢，紅對紅，黑對黑將電泳槽和電泳儀接好，打開電源，電壓調(diào)至60-100V之間。一般來說樣品在上層膠時電壓可稍高，進入下層膠后較低的電壓容易將個分子量蛋白粉理清楚。溴酚藍自膠
3、內(nèi)跑出后電泳結(jié)束。4.電轉(zhuǎn)：1）準備PVDF膜及濾紙。PVDF大小8.2х5～5.5，濾紙按電轉(zhuǎn)海綿大小剪，一塊膠準備四張濾紙。2）將PDVF膜置于干凈的容器中，倒入適量甲醇浸泡1～3分鐘，然后浸泡于電轉(zhuǎn)浸泡液中。3）12WesternBloting小心取出兩層玻璃之間的膠，切去上層膠。在電轉(zhuǎn)液中完成如下：電轉(zhuǎn)孔板黑色面鋪放海綿一張，依次鋪放濾紙兩張，膠一塊，PVDF膜一張，濾紙再兩張，海綿再一張，然后小心扣好孔板，將其黑色面對黑色面扣入電轉(zhuǎn)架，將電轉(zhuǎn)架放入電泳槽。電泳槽內(nèi)置小冰盒一個，整個電泳槽置于大冰盒中。1）接好電源，按蛋白分子量大小調(diào)整電壓。一般小分子量適合
4、低電壓，大分子量適合高電壓。5.封閉：1）電轉(zhuǎn)完畢后取出PVDF膜，置于5%的脫脂奶溶液中封閉。一小時或者4℃過夜。2）一抗反應(yīng)：將抗體以10ml5%脫脂奶適合稀釋，將PVDF膜浸入其中，置于脫色搖床上促進反應(yīng)1小時。表達豐度低的蛋白可適當加長時間，比如4℃冷庫過夜。6.回收抗體。7.TBST液搖洗膜，15分鐘х3次8.二抗反應(yīng)：相應(yīng)二抗以1：2000比例稀釋至10ml。PVDF膜置于其中要洗40—50分鐘。9.TBST液洗膜，15分鐘х3次10.暗房發(fā)光洗片。所需物品：濾紙，保鮮膜，壓片盒，X光片，小鑷子，1000ul移液器，槍頭，配制發(fā)光液，solutionⅠ：
5、solutionⅡ=1:1，一張膜需要2ml。1）用紙吸干PVDF膜水分，在保鮮膜上浸泡于發(fā)光液1分鐘，期間用鑷子翻轉(zhuǎn)幾次促進均勻反應(yīng)。用紙吸干PVDF膜上剩余的發(fā)光液，裹于干凈的保鮮膜里，只需一層。2）PVDF膜平鋪于壓片盒，關(guān)燈，取X光片1~~2張鋪與其上，扣緊壓片盒。根據(jù)需要定制曝光時間。一般第一張1~5分鐘。將剩余X光片密封避光保存妥善。3）取出壓片盒中X光片投入自動洗片機中沖洗。WesternBloting相關(guān)試劑：12WesternBlotingAcrylamide/Bisacrylamide30%(w/v)acrylamide(丙烯酰胺)(Bio-Ra
6、d161--0101)0.8%(w/v)methelenebisacrylamide(N-N’亞甲基雙丙烯酰胺)（Gibco155-16-024）丙烯酰胺（Acr）29g亞甲基雙丙烯酰胺(Bic)1g超純水至100ml37℃下溶解后，4℃brownbottle保存，使用時恢復至室溫且無沉淀。4хLowerTris500mlTrisbase(1.5M,m.w.121.1)90.83g10%SDS20ml超純水至500mlPHto8.8(aboutHCL12ml)4хUpperTris,200mlTrisbase（0.5M）12.12g10%SDS8ml超純水至200m
7、lPHto6.8(aboutHCL8ml)10%AmmoniumPersulfate(過硫酰胺，APS，10%，W/V)（Bio-Rad161-0800）總量10mlAmmoniumPersulfate1gDH20to10ml溶解后，分裝后-20℃保存，每次用一支（200ul），保存時間為一周。Temed:12WesternBloting2хSampleBuffer,50mlGlycerol10ml20%SDS15ml4хUpperTris12.5mlH2Oto50ml1хSampleBuffer1.5ml2ml3ml4ml5ml10ml20ml50mlH2O(
