基因槍轉(zhuǎn)化燦稻的影響因素

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1、基因槍轉(zhuǎn)化燦稻的影響因素第37卷第1期1998年i月中山大學(xué)(自然科學(xué)版)ACTASCIENTIARUMNATURALIUMUN1VERS1TATTSSUNYATSEN1Vo1.37No1Jani998,o)g一c7//基因槍轉(zhuǎn)化秈稻的影響因素究,明/-州1李02寶75)510275健ff,(中山大學(xué)生物工程研究中心,州/摘要將含有g(shù)usA基因的質(zhì)粒pActI—D包裹在鎢粉上轟擊秈稻初生愈傷組織,通過(guò)檢測(cè)gusA基因在秈稻細(xì)胞中的瞬間表達(dá)情況.對(duì)影響基因槍法轉(zhuǎn)化效率的固索進(jìn)行了研究,這些固索包括傲粒加速裝置參散,微粒參數(shù),生物參數(shù)及其它參數(shù).實(shí)驗(yàn)表明

2、,在合適的轉(zhuǎn)化條件下.秈稻品種青風(fēng)占12,穗優(yōu)占的最高轉(zhuǎn)化效率分別為439,915藍(lán)點(diǎn)/皿.關(guān)鍵詞分類(lèi)號(hào)i莖墾絲蓮t圭璺籩塑塑-墮笪墼璧.(GUS),轉(zhuǎn)化效率Q812秈稻和粳稻是水稻的2個(gè)主要亞種,其中秈稻占水稻栽培品種的80,為全世界20億以上的人口提供了主食.自1991年基因搶法轉(zhuǎn)化水稻獲得成功以來(lái),不少實(shí)驗(yàn)室對(duì)水稻的基因槍轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)一.但是,與粳稻品種相比,秈稻品種的轉(zhuǎn)化較為困難,轉(zhuǎn)化頻率比較低,培養(yǎng)周期過(guò)長(zhǎng),絕大多數(shù)在生產(chǎn)上有應(yīng)用價(jià)值的優(yōu)良品種難"轉(zhuǎn)化成功本文廣卅I地區(qū)推廣的優(yōu)良秈稻品種為轉(zhuǎn)化材料,對(duì)影響基因搶法轉(zhuǎn)化效率(y)的主要因

3、素進(jìn)行了分析,為建立高效的秈稻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)打下基礎(chǔ).1材料與方法l,1基因槍本研究采用的JQ一700型高速基因槍(中科院生物物理所研制)為火藥爆發(fā)氣體推進(jìn)式,可供選用的參數(shù):火藥彈為綠彈,藍(lán)彈和紅彈,其動(dòng)力負(fù)荷依次增高;火藥套管長(zhǎng)ljmm,25mm,35mm,其相應(yīng)配套的加速管分別為52mm,42mm,32mm;濾網(wǎng)為4o目,80目及100目;空氣壓力()為0.10～0.0lMPa,連續(xù)可調(diào);靶距為6cm或9cm.1.2植物材料供試秈稻(~yzasativaL.ssp.indlcaKato)品種為青風(fēng)占l2和穗優(yōu)占,去殼的種子消毒后,接種在MS愈傷組織培

4、養(yǎng)基上.在暗中誘導(dǎo)培養(yǎng)2～14d后,分離出盾片部位誘導(dǎo)生長(zhǎng)的愈傷組織作為靶樣品.1.3質(zhì)粒質(zhì)粒pActl—D(由吳瑞教授贈(zèng)送)含有由水稻Act一1啟動(dòng)子調(diào)控的gusA基因.采用堿?美國(guó)Rocketeller基金資助項(xiàng)目收稿日期:1997—04—24許新萍.女.32歲.講師r幾rr珊

5、第1期許新萍等:基因槍轉(zhuǎn)化秈稻的影響因索89裂解法提取質(zhì)粒DNA,并用PEG法加以純化.1.4包裹質(zhì)粒DNA的微粒的制備按照Sanford等【.:方法對(duì)鎢粉進(jìn)行處理.微粒的包裹方法作了改進(jìn):取2jL鎢粉懸浮液(60p.g/~tL)用超聲波清潔機(jī)超聲處理3s,然后在不斷旋渦

6、混勻情況下依次加入1～7.5L1~g/uL質(zhì)粒DNA252.5mol/LCaC12及1O0,1mol/L亞精氨,將該混臺(tái)液超聲處理3s,置于冰上10min,脈沖離心(1000r/rain),吸去50L上清披,其余溶液混勻后即可上樣,每次用量為1～7.5,注到塑料彈端部凹坑內(nèi).1.5基因槍轉(zhuǎn)化將愈傷組織置于含MS愈傷組織培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央約1.5em直徑范圍內(nèi),按照該基因槍說(shuō)明書(shū)所述程序?qū)Π袠悠愤M(jìn)行轟擊,每皿樣品轟擊1或2次,每種參數(shù)重復(fù)試驗(yàn)4皿樣品.在部分實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)化時(shí)將愈傷組織放在含0.5mol/L滲壓劑(等量的甘露醇和山梨醇)的MS愈傷組織培養(yǎng)基

7、上培養(yǎng)6h.1.6GUS檢測(cè)經(jīng)基因槍轉(zhuǎn)化處理的愈傷組織暗培養(yǎng)48h后,按照J(rèn)efferson等【:方法進(jìn)行組織化學(xué)染色.在Olympus解剖鏡下觀察和統(tǒng)計(jì)gusA基因瞬間表達(dá)產(chǎn)物與底物X-GLue反應(yīng)產(chǎn)生的藍(lán)點(diǎn),每個(gè)藍(lán)點(diǎn)作為1個(gè)"表達(dá)單位",y由每皿的藍(lán)點(diǎn)數(shù)目代表24].2結(jié)果與討論2.1微粒加速裝置參數(shù)對(duì)y的影響2.1.1火藥彈動(dòng)力負(fù)荷,火藥套管/iv速管長(zhǎng)度使用藍(lán)彈或綠彈,15mm火藥套管,52mm加速管時(shí),y較高.而用紅彈,15mm火藥套管,52mm加速管時(shí),y幾乎為零(表1).火藥彈動(dòng)力負(fù)荷越高,火藥彈至塑料彈的距離(gg火藥套管長(zhǎng)度)越短,

8、塑料彈加速飛行距離(即加速管長(zhǎng)度)越長(zhǎng),塑料彈能夠達(dá)到的撞擊擋板的速度就越高,因而微粒獲得的初速度也越高,越能有效地穿透細(xì)胞壁,細(xì)胞膜,將外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi).但同時(shí),靶樣品受到的沖擊波也越強(qiáng)一,越易引起嚴(yán)重的細(xì)胞損傷,反而降低了y.表1火藥彈,火藥套管/加速管及濾網(wǎng)對(duì)秈稻y的影響"Tab?1Effectofpo~erload,distancefromDower∞uⅫ【omac:oprojecti.1e/macropmjeeti.1eflightdistanceandmeshesoDtransformationefficiencyofindicaric

9、e藍(lán)點(diǎn)數(shù)?皿1)轉(zhuǎn)化條件:品種為青風(fēng)占12;產(chǎn)一0.OlMPa}靶距為6cm{d*=0.9m;m(DNA)r