notch信號通路相關基因的表達與涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移的關系

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1、Notch信號通路相關基因的表達與涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移的關系作者：盧友光佘林林李嵩張聲丁林燦【摘要】目的篩選與涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移相關的Notch信號通路基因。方法對已構建的涎腺腺樣囊性癌高低轉(zhuǎn)移細胞株ACCM、ACC2基因表達譜進行生物信息學分析，在與Notch信號通路基因進行比對后，篩選出差異基因，通過熒光實時定量PCR技術對相關基因的表達差異進行初步驗證。結果涎腺腺樣囊性癌的表達譜中有46個基因與Notch信號通路有關。驗證發(fā)現(xiàn)，Notch1,Notch2,Notch4，CHUK，F(xiàn)OXC1，F(xiàn)ZD2

2、，F(xiàn)ZD3，GBP2和RUNX1在2個細胞株中的表達差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，同時Notch1在發(fā)生轉(zhuǎn)移的涎腺腺樣囊性癌中的表達明顯高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的涎腺腺樣囊性癌（P<0.05）。結論Notch信號通路中的多個基因可能參與了涎腺腺樣囊性癌的發(fā)生和發(fā)展；Notch1的表達與涎腺腺樣囊性癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關?！娟P鍵詞】癌，腺樣囊性；涎腺腫瘤；聚合酶鏈反應；細胞，培養(yǎng)的；基因表達；信號傳導11涎腺腺樣囊性癌是口腔唾液腺常見的惡性腫瘤之一，該腫瘤的惡性程度高，術后易于復發(fā)，患者預后較差。目前認為

3、多種分子涉及該腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移，包括P53、P16、P27、MMPs等。Notch信號通路是一條古老的信號通路，相鄰細胞通過Notch信號通路的傳遞，決定細胞的增殖或凋亡，它參與胚胎發(fā)育，T細胞的發(fā)育，以及維持造血干細胞自我更新等。筆者采用第二代差異顯示技術構建了涎腺腺樣囊性癌高低轉(zhuǎn)移細胞株的基因表達譜，通過生物信息學分析和半定量RTPCR，發(fā)現(xiàn)Notch基因家族4個成員在ACC2，ACCM2個細胞株間存在表達差異[1]。本研究采用熒光定量PCR進一步驗證Notch基因家族在這2個細胞株中表達的差異，分

4、析Notch信號通路42個主要相關基因表達的變化，尋找與涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移相關的基因。1材料與方法1.1材料人涎腺腺樣囊性癌高轉(zhuǎn)移細胞株ACCM和低轉(zhuǎn)移細胞株ACC2由上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科腫瘤實驗室惠贈。其中ACCM為ACC2經(jīng)過裸鼠體內(nèi)連續(xù)傳代培養(yǎng)分離出的高轉(zhuǎn)移細胞株。免疫組織化學標本為福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院手術切除并經(jīng)病理確診為涎腺腺樣囊性癌的腫瘤石蠟組織標本，其中發(fā)生轉(zhuǎn)移者11例，未轉(zhuǎn)移者14例。1.2主要試劑和儀器Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；Pri

5、meScriptRTreagentKit、SYBRPremixExTaq(日本TaKaRa公司)；Notch1兔多克隆抗體(美國Neomarker公司)；UltraSensitive11SP超敏試劑盒、磷酸鹽緩沖液PBS、檸檬酸鹽抗原修復液、加強型DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）。MastercyclerGradient5331PCR儀(德國Eppendorf公司)；TP800熒光定量PCR儀(日本TaKaRa公司)；GeneSnap凝膠成像系統(tǒng)(英國SynGene公司)；石蠟自動包埋脫水機、連

6、續(xù)切片機（德國Leica公司）。1.3篩選Notch信號通路相關基因根據(jù)文獻[2]構建的涎腺腺樣囊性癌基因表達譜，進行生物信息學分析，使用圖像分析軟件測量出所有片段在凝膠上的遷移距離。SAS統(tǒng)計軟件進行曲線擬合，找出最佳擬合曲線，計算各片段bp值。根據(jù)擬合結果，以片斷大小和所在“表達窗”作參數(shù)，按2%容許誤差從數(shù)據(jù)庫(QbiogeneInc＆MPBiomedicalsInc公司)確定其所對應的基因，每個片段數(shù)據(jù)均與NCBIGeneBank直接鏈接，從而對涎腺腺樣囊性癌的基因表達譜進行分析，初步得出相關基因。根據(jù)

7、文獻[36]查找Notch信號通路上下游相關基因共113個，通過與文獻[2]構建的表達譜中所得到的5420個基因片段的信息進行比對，選出在兩者中共有的基因共46個，通過NCBIGenebank和UCSC查詢46種基因的序列，使用Primer3(v.0.4.0)在線設計引物（表1），引物委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。1.4細胞株培養(yǎng)將ACCM、ACC112細胞株復蘇、傳代、培養(yǎng)、取第4代對數(shù)生長期細胞通過Trizol法提取抽提RNA，用紫外分光光度儀檢測RNA純度和濃度。通過分光光度儀測定260n

8、m和表146種基因及內(nèi)參照引物　　280nm的值，兩者比值在1.7～2.0，并根據(jù)260nm將各個樣品總RNA稀釋至相同濃度，使用PrimeScriptRTreagentKit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。1.5熒光實時定量PCR分析反應體系包括：cDNA2.0μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，SYBRPremixExTaq12.5μL，去離子水加至總體積25