鈣黏素家族相關(guān)基因與涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系

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1、鈣黏素家族相關(guān)基因與涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系作者：佘林，丁林燦，王錦鋒，盧友光【摘要】　　目的篩選與涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的鈣黏素(CDH)家族基因。方法對(duì)涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移能力不同的兩個(gè)細(xì)胞株的基因表達(dá)譜進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選出可能與轉(zhuǎn)移相關(guān)的CDH家族基因，通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)差異進(jìn)行驗(yàn)證，并用免疫組織化學(xué)技術(shù)研究有差異的CDH基因在臨床樣本中的表達(dá)及其與轉(zhuǎn)移的關(guān)系。結(jié)果生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)譜中有14個(gè)CDH家族基因在兩個(gè)細(xì)胞株中的表達(dá)有差異，實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)CDH4、CDH5、CDH12在兩細(xì)胞株之

2、間的表達(dá)差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)CDH12在有轉(zhuǎn)移的臨床標(biāo)本中的表達(dá)高于沒(méi)有轉(zhuǎn)移的標(biāo)本((P<0.05)。結(jié)論CDH12可能與涎腺腺樣囊性癌的高轉(zhuǎn)移能力有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】癌,腺樣囊性；涎腺腫瘤；鈣黏著糖蛋白類(lèi)；聚合酶鏈反應(yīng)；免疫組織化學(xué)　　ABSTRACT:ObjectiveToexploretherelationshipoftheexpressionofcadherinfamilygenesandthemetastasisofadenoidcysticcarcinoma.MethodsThegenes

3、ofadenoidcysticcarcinomaaticsanalysisfromACC2andACCMgeneexpressionspectra.ThecorrelativegenesinvolvingCDHfamilyined.RealtimePCRinethemRNAlevelofthesegenesintheACC2andACCM.Thenimmunohistochemicalmethodsa.ResultsForteenkindsofgenesgeneexpressionprofile.RealtimePCRdemo

4、nstratedthattheexpressionofCDH4andCDH12inACCMetastasisandrecurrencethanayplayanimportantroleinthemetastasisofadenoidcysticcarcinoma.　　KEY和低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株ACC2由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科腫瘤實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。其中ACCM為ACC2經(jīng)過(guò)裸鼠體內(nèi)連續(xù)傳代培養(yǎng)分離出的高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株。免疫組織化學(xué)標(biāo)本為1998-2008年福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院和福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理確診

5、為涎腺腺樣囊性癌的腫瘤石蠟組織標(biāo)本，其中發(fā)生轉(zhuǎn)移的23例，未轉(zhuǎn)移57例?！　?.1.2主要試劑　　Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）、PrimeScriptRTreagentKit（日本TaKaRa公司）、SYBRPremixExTaq(日本TaKaRa公司)、CDH12抗體(美國(guó)RD公司)、UltraSensitiveSP超敏試劑盒、磷酸鹽緩沖液PBS、檸檬酸鹽抗原修復(fù)液、加強(qiáng)型DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）。　　1.1.3主要儀器　　梯度PCR儀(MastercyclerGradient5331，德國(guó)

6、Eppendorf公司)、熒光定量PCR儀(TP800，日本TaKaRa公司)、GeneSnap凝膠成像系統(tǒng)(InGeniusLHR，英國(guó)SynGene公司)、石蠟自動(dòng)包埋脫水機(jī)（H2245，德國(guó)LEIca公司）?！　?.2方法　　1.2.1篩選CDH家族基因　　根據(jù)盧友光等構(gòu)建的涎腺腺樣囊性癌基因表達(dá)譜，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，使用圖像分析軟件測(cè)量出所有片段在凝膠上的遷移距離[5]。SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行曲線擬合，找出最佳擬合曲線，計(jì)算各片段bp值。根據(jù)擬合結(jié)果，以片斷大小和所在“表達(dá)窗”作參數(shù)，按2％容許誤差從數(shù)據(jù)庫(kù)(QbiogeneInc

7、．＆MPBiomedicalsInc公司提供)確定其所對(duì)應(yīng)的基因，每個(gè)片段數(shù)據(jù)均與NCBIGeneBank直接鏈接，從而對(duì)涎腺腺樣囊性癌的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析初步得出與CDH家族相關(guān)基因14種。通過(guò)NCBIGenebank和UCSC查詢14種基因的序列，使用Primer3(v.0.4.0)在線設(shè)計(jì)引物（表1），引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。表114種基因以及內(nèi)參照引物（略），Tab114kindsofgenesandinternalreferenceprimer（略）。　　1.2.2實(shí)時(shí)定量熒光PCR　　通過(guò)Trizol法抽

8、提RNA，用紫外分光光度儀檢測(cè)RNA純度和濃度。純度和濃度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求后，將各個(gè)樣品總RNA稀釋至相同濃度，使用PrimeScriptRTreagentKit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光