rnai沉默survivin基因?qū)σ认侔┘?xì)胞增殖、凋亡和周期的影響

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1、RNAi沉默survivin基因?qū)σ认侔┘?xì)胞增殖、凋亡和周期的影響作者：田維軍趙金偉宋曉斌【摘要】目的應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默胰腺癌細(xì)胞株中survivin基因?qū)δ[瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和增殖的變化。方法靶向survivin的RNAi載體轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞，Western印跡檢測(cè)基因沉默效果，MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期。結(jié)果survivin基因沉默效率可達(dá)85%；MTT檢測(cè)顯示，干擾組survivin沉默細(xì)胞增殖抑制與非特異性質(zhì)粒對(duì)照組相比顯著增高（P<0.01）。流式細(xì)胞術(shù)顯示，干擾組細(xì)胞凋亡百分率顯著高于非特異性質(zhì)粒對(duì)照組（P<0.01）；G2/M期顯著高于非特異

2、性質(zhì)粒對(duì)照組（P<0.01或P<0.05），而S期則顯著降低（P<0.05）。結(jié)論survivin基因沉默可引起胰腺癌細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖?！娟P(guān)鍵詞】RNAi；survivin；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期；胰腺癌9胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲、轉(zhuǎn)移是多基因參與、多步驟發(fā)生的過(guò)程，其中生存素（survivin）是一類在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起非常重要作用的癌基因〔1〕，其參與細(xì)胞多種重要生物學(xué)過(guò)程，包括基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、胚胎發(fā)生、細(xì)胞分化、腫瘤形成和轉(zhuǎn)移等〔1，2〕。survivin在胚胎期表達(dá)豐富，而在成熟組織中則表達(dá)極少或缺失，但在病理情況下，包括胰腺癌的很多惡性腫瘤

3、組織中均發(fā)現(xiàn)有survivin的高水平表達(dá)，并且其表達(dá)量與腫瘤惡性程度及轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)〔1，3〕。survivin的過(guò)表達(dá)和激活不僅與預(yù)后不良密切相關(guān)，而且能影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，是胰腺癌基因治療的潛在靶點(diǎn)之一〔4，5〕。本研究選擇survivin分子作為干擾靶點(diǎn)，檢測(cè)沉默該基因后對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響，為進(jìn)一步研究survivin基因在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性及免疫抑制中的作用構(gòu)建技術(shù)平臺(tái)?！　?材料與方法　　1.1主要試劑　　人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)C3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物研究所細(xì)胞庫(kù)，以含10%胎牛血清（Hyclone公司）的DMEM（Gibco公司）培養(yǎng)基，37℃，5%C

4、O2孵箱（SANYO）培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000（美國(guó)Gibco公司），ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國(guó)Pierce公司），小鼠抗人單克隆survivin抗體（SantaCruz公司）。干擾質(zhì)粒pGenesil2、非特異性siRNA（武漢市晶賽生物工程技術(shù)有限公司），pGensilsiRNAsurvivin質(zhì)粒由本室構(gòu)建。AnnexinV凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司?！　?.2細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染9　　轉(zhuǎn)染前1d將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胰腺癌細(xì)胞株P(guān)C3以2×105個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞鋪板在2ml含血清、不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，24h內(nèi)、細(xì)胞融合達(dá)40%～6

5、0%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將siRNALipofectamineTM2000復(fù)合體加到培養(yǎng)板中（轉(zhuǎn)染方法按試劑盒說(shuō)明書操作），轉(zhuǎn)染體系為500μl，siRNAs終濃度為100nmol/L?！　?.3Western印跡檢測(cè)基因沉默效果　　收集細(xì)胞，用PBS緩沖液漂洗3次，加入200μl細(xì)胞裂解液混勻、冰浴30min。15000r/min離心10min，以Lowry′s法行總蛋白定量分析。制備12％分離膠、5％積層膠，上樣，在8V/era電壓條件下行SDS聚丙烯酰胺電泳，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠時(shí)，將電壓提高到15V/era。電泳結(jié)束后，將分離出的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上（Millipore，USA），5％脫

6、脂奶粉的TBS溶液封閉2h，鼠抗人單克隆一抗和βactin室溫孵育2h，二抗室溫孵育1.5h，ECL試劑盒顯色，拍照，比較各組灰度變化。分為siRNA干擾組、siRNA干擾對(duì)照組(用非特異siRNALipofectamineTM2000復(fù)合體轉(zhuǎn)染)、空載體組(以空白載體復(fù)合體轉(zhuǎn)染)、未轉(zhuǎn)染對(duì)照組(以等量培養(yǎng)基處理)作為對(duì)照，觀察各組干擾效果?！　?.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖9　　將各組細(xì)胞以2000個(gè)/孔的密度接種于96孔板，體積200μl/孔。分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72h進(jìn)行MTT檢測(cè)，酶標(biāo)儀測(cè)定570μm處OD值，連續(xù)測(cè)定3d。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)5個(gè)復(fù)孔，根據(jù)吸光度值繪制曲線，比較各組細(xì)胞

7、生長(zhǎng)速度變化。分為siRNA干擾組和非特異性轉(zhuǎn)染對(duì)照組?！　?.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡　　分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72h收集細(xì)胞，冷PBS洗滌2次，－20℃預(yù)冷的70%乙醇固定48h，1200r/min離心10min棄上清，1000μlPBS重懸加10mg/mlRNase20μl混勻，37℃水浴45min，PBS洗Rnase，100μlPBS重懸，100μlPI4℃避光染色1h。流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光