β分泌酶原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及融合蛋白純化

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1、β分泌酶原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及融合蛋白純化作者：朱愛(ài)華李敬陸軍錢進(jìn)鄭元林【摘要】目的構(gòu)建小鼠β分泌酶原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)其表達(dá)和純化，為進(jìn)一步研究β分泌酶的作用奠定基礎(chǔ)。方法根據(jù)基因文庫(kù)中小鼠β分泌酶基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，采用RTPCR方法擴(kuò)增到β分泌酶的cDNA片段，克隆進(jìn)原核表達(dá)載體pET28a中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，測(cè)序鑒定后，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白，經(jīng)親合層析純化。結(jié)果從小鼠的腦組織RNA中擴(kuò)增出特異的β分泌酶基因片段長(zhǎng)1506bp，經(jīng)酶切鑒定及DNA序列測(cè)定，證實(shí)重組載體pET28aBACE構(gòu)建正確，表達(dá)融合蛋白分子量約為55kD

2、，經(jīng)鎳離子親合柱層析純化獲得電泳級(jí)純度的目的蛋白。結(jié)論在大腸桿菌中獲得了小鼠β分泌酶的高效表達(dá)，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】β分泌酶；大腸桿菌；表達(dá)；融合蛋白【Abstract】ObjectiveTobuildmiceβsecretaseprokaryoticexpressionvectorandinduceitsexpressionandpurification,toaffordbasisforβsecretaseresearch.MethodsPrimerwasdesignedbymiceβsecretasegenecDNAinGenbank.cD

3、NAsegmentofβsecretasegenewasamplifiedbyRTPCR,thenclonedinto9prokaryoticexpressionvectorpET28aandtransformedintoE.coliBL21(DE3).Aftersequencedandidentified,fusionproteinwasinduced,expressedandpurified.ResultsSpecialβsecretasegenesegmentamplifiedfromRNAofmicebraintissuewas1506bp.Afteridenti

4、fiedandsequenced,recombinantvectorwasprovedcorrect,itsfusionproteinhadamolecularweightof55kD.Electrophoresispuritytargetproteincouldbeacquired.ConclusionsMiceβsecretasehasahighexpressioninE.coli,whichbuildabasisforresearchofβsecretase′sbiologicalfunctionanditsapplication.【Keywords】βsecretas

5、e;E.coli;Expression;Fusionprotein　　阿爾茨海默病(AD)是發(fā)病率最高，危害最大的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病〔1〕。淀粉樣斑塊是其主要病理特征之一，主要成分β淀粉樣蛋白(Aβ)在AD的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，因此阻斷或延遲AD早期Aβ的積聚成為治療AD的切入點(diǎn)。β分泌酶(BACE)是淀粉樣前體蛋白(APP)水解產(chǎn)生Aβ9的關(guān)鍵酶，是干預(yù)AD進(jìn)程的理想靶點(diǎn)〔2〕。通過(guò)酵母或昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)活性BACE在最近已見(jiàn)報(bào)道。然而，由于上述系統(tǒng)表達(dá)的蛋白量低，不適合BACE抑制劑的大規(guī)模篩選〔3，4〕。而B(niǎo)ACE的原核表達(dá)可克服以上缺陷，為篩選特異性抑制劑

6、及研究BACE結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供大量材料，為最終從根本上治療AD帶來(lái)希望。本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，選用pET28a作為表達(dá)載體獲得小鼠BACE，經(jīng)鎳離子固定金屬親和層析純化目的蛋白，以便進(jìn)一步研究其功能?！　?材料與方法　　1.1主要材料　　2月齡昆明小鼠(購(gòu)自徐州醫(yī)學(xué)院)；宿主菌E.coliBL21(DE3)(由本實(shí)驗(yàn)室保存)；質(zhì)粒pET28a(購(gòu)自Novagen公司)；限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4DNA連接酶等工具酶(購(gòu)自大連寶生物工程公司)；Trizol試劑及AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Promega公司)；PfuDNA聚合酶及溶菌酶(上海生工生物工程公司

7、)；PCR純化和膠回收試劑盒(購(gòu)自上海華舜生物工程公司)；DNAmarker、中分子量蛋白質(zhì)marker是Fermentas公司產(chǎn)品；鎳離子親合層析柱(Novagen公司產(chǎn)品)；其他化學(xué)試劑均為分析純。　　1.2寡核苷引物的設(shè)計(jì)與合成　　根據(jù)基因文庫(kù)中小鼠BACE基因的cDNA序列及相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成2條引物P1:5′TAGGATCCATGGCCCCAGCGCTGCACT3′(劃線部分為BamHⅠ9酶切位點(diǎn))；P2:5′CGGAATTCTTACTTGAGCAGGGAGATGTCA