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《人AChR—Fc融合蛋白真核表達載體的構(gòu)建和表達(1)》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、·276·中國神經(jīng)免疫學和神經(jīng)病學雜志201i年7月第18卷第4期ChinJNeuroimmunol&Neurol2011，Vo1．18，No．4人AChR—Fc融合蛋白真核表達載體的構(gòu)建和表達常婷林宏劉煜李柱一摘要：目的構(gòu)建含人AChRal亞單位胞外段(Hal一210)一IgG1Fc融合基因的真核表達載體，表達人AChR—Fc融合蛋白。方法擴增Hal-210基因，插入含有CMV啟動子、小鼠Kappa鏈先導序列以及人IgG1從鉸鏈區(qū)到CH3基因片段的真核表達載體pAN1782中，構(gòu)建重組表達載體pAN—Hal一210，并經(jīng)酶切、測序鑒定；采用脂質(zhì)體
2、法將重組載體轉(zhuǎn)染CHO-K1細胞，經(jīng)G418加壓篩選、ELlSA檢測，挑選高表達融合蛋白的陽性轉(zhuǎn)化子擴大培養(yǎng)；表達的AChR—Fc融合蛋白經(jīng)ProteinA親和層析柱純化，SDS-PAGE、Westernblot鑒定。結(jié)果酶切及測序結(jié)果證實Hal一210基因序列正確，真核表達載體pAN—Hal一210構(gòu)建成功；ELISA檢測證實＼ChR—Fc融合蛋白在細胞培養(yǎng)上清中呈分泌表達；SDS-PAGE結(jié)果顯示該融合蛋白的相對分子質(zhì)量約為5【000；Westernblot結(jié)果顯示該融合蛋白能被特異性單克隆抗體mAb198所識別。結(jié)論成功構(gòu)建pAN—Hal一2
3、1O真核表達載體，并獲得具有生物活性的AChR—Fc融合蛋白，為進一步開展融合蛋白靶向B細胞治療重癥?。篔己力的研究奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：重癥肌無力；融合蛋白；真核表達；CHO—K1細胞中圖分類號：R746．1文獻標識碼：A文章編號：1006—2963(2011)04—0276—04ConstructionandexpressionofafusionproteincontainingextracellulardomainofhumanAChRalandFcfragmentofhumanIgG1CHANGTing，LINHong，LJUY，LZhu—y
4、i．DepartmentofNeurology，TangduHospital，gFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’anShaanxi710038，ChinaCorrespondingauthor：LIZhu～yi，Email：lizhuyi@fmmu．edu．cn．ABSTRACT：ObjectiveToconstructeukaryoticexpressionvectorcontainingtheextracellulardomainofthehumanAChRM—subunit(Hal一210)andFcfr
5、agmentofhumanIgG1，andtoexpresshumanAChR—Fcfusionprotein．MethodsTheextracellulardomainofHal一210wasamplifiedandinsertedintopAN1782eukaryoticexpressionvectorwithacytomegaloviruspromoter，amurineimmunoglobulini~-chainleadersequenceandthehumangenomicIgG71constantregionfromthehingeto
6、theendofCH3．RecombinantexpressionvectorpAN—Hal一210wasconstructedandevaluatedbyrestrictionenzymeanalysisandsequencing．TherightpAN—Hal一210plasmidwastransfectedintoCHO—K1cellswithlipofectinreagentandselectedbyG418．Thepositiveclonewithhighexpressingfusionproteinwereselectedthrough
7、ELISAdetectionandcultured．AfterpurifiedbyproteinAaffinitycolumnchromatography，theAChR—FcfusionproteinwasidentifiedbySDS_PAGEandWesternblotassay．ResultsRestrictionenzymeandsequencingindicatedHal一210genesequencewascorrectandpAN—Hal一210hadbeenconstructedsuccessfully．AChR—Fcfusion
8、proteincouldbedetectedbyELISAassayintheCHO-K1culturesupernata
