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1、原創(chuàng)性聲明J／僦Y1㈧8349№3“6?1本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的科研成果。對(duì)本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者：日期：年月日學(xué)位論文使用授權(quán)聲明本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下完成的論文及相關(guān)的職務(wù)作品，知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬鄭州大學(xué)。根據(jù)鄭州大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留或向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱；本人授權(quán)鄭州大學(xué)可以將本
2、學(xué)位論文的全部或部分編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或者其他復(fù)制手段保存論文和匯編本學(xué)位論文。本人離校后發(fā)表、使用學(xué)位論文或與該學(xué)位論文直接相關(guān)的學(xué)術(shù)論文或成果時(shí)，第一署名單位仍然為鄭州大學(xué)。保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定。學(xué)位論文作者：日期：年月日中文摘要TAT-BPI．gB融合蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建研究碩士研究生趙院霞導(dǎo)師闞全程教授鄭州大學(xué)第一臨床學(xué)院藥學(xué)部鄭州450052為了有效減少細(xì)菌的抗藥性，促進(jìn)對(duì)感染細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌有效清除，尤其是針對(duì)革蘭陰性菌感染，研究對(duì)抗內(nèi)毒素特異有效的制劑。本實(shí)驗(yàn)利用①人體免疫缺陷病毒(HumanImmunodefi
3、dencyV'masHIV)的逆轉(zhuǎn)錄因子(tram—activatorTAT)蛋白的功能．促進(jìn)HIV病毒進(jìn)入分裂或未分裂細(xì)胞；②巨細(xì)胞病毒(HumancytomegalovimsHCMV)嚴(yán)格的細(xì)胞嗜性．特異性與單核巨噬細(xì)胞結(jié)合。擬將HCMV結(jié)合受體膜糖蛋白gB中保守基因ADl及具有泛嗜性TAT蛋白與BPI基因融合表達(dá)，旨在賦予修飾后BPI一個(gè)新的功能：可以高效率穿透細(xì)胞膜或者多種屏障，如血腦屏障或菌膜，同時(shí)利用巨噬細(xì)胞的導(dǎo)向作用使融合蛋白具有中和不同解剖分布狀態(tài)的LPS的功能，結(jié)果在于①對(duì)LPS．LBP、LPS．HDL有中和作用，具有延時(shí)保護(hù)效果；②細(xì)
4、胞內(nèi)感染細(xì)菌有清除作用，預(yù)防感染的復(fù)發(fā)；③中和活性較單純BPI進(jìn)一步提高；④提高BPI的滲透作用，有利于治療各種難治性感染；⑤改變普通抗生素的作用機(jī)制，減少細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，從而為臨床膿毒癥及敗血癥、內(nèi)毒素血癥等的治療找到一條新的有效途徑。目的：為使BPI能高效率穿透細(xì)胞膜或多種屏障，中和不同解剖部位的LPS，構(gòu)建TAT．BPI．ga原核表達(dá)載體并鑒定，為研制以BPI為基礎(chǔ)的多肽抗生素打下基礎(chǔ)。方法：1．BPIeDNA片段的擴(kuò)增：PMN提取，Trizol提取細(xì)胞總鼢峪，將RNA轉(zhuǎn)錄為eDNA，利用特異性BPI引物進(jìn)行PCR得至IJBPIDNA片段。2．pU
5、C57-TAT．BPI重組質(zhì)粒的構(gòu)建：將人工合成的n盯互補(bǔ)單鏈混合，得到雙鏈片段。將TAT雙鏈片段經(jīng)PaeI、SalI雙酶切后，與pUC57載體連接，中文摘要構(gòu)建pUC57．n盯重組質(zhì)粒。將PCR擴(kuò)增得到的BPI片段用SalI、KpnI雙酶切后，與重組質(zhì)粒pUC57-TAT連接，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5a，提取質(zhì)粒并鑒定。3．gBDNA片段的擴(kuò)增：依據(jù)Gencbank@GQ166969提供的UL55基因序列，人工合成人巨細(xì)胞病毒糖蛋白gB的UL55編碼中ADl序列，利用gB引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到該DNA片段。4．pUC57-TAT—BPI-ga融合蛋白載體
6、的構(gòu)建：將PCR擴(kuò)增得到的gB片段用KpnI、EcoRI雙酶切后，與重組質(zhì)粒pUC57-TAT-BPI連接，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5a，提取質(zhì)粒并酶切及測(cè)序鑒定。5．同源性分析：應(yīng)用計(jì)算機(jī)blast軟件將重組蛋白TAT-BPI．gB與Genebank中n盯(YGRKKRRQRRR)序列、gB序列UL55(28個(gè)氨基酸)和BPI全序列AF322588中N端(1-597基因片段)等參照序列進(jìn)行同源性分析比較。結(jié)果：1％瓊脂糖凝膠電泳顯示BPI基因大小約600bp、ga基因約80bp。pUC57-TAT-BPI和pUC57-TAT-BPI．ga重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和
7、酶切鑒定，1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示條帶在600bp和700bp左右。同源性分析"汀序列中，第10，30位核苷酸有突變，核苷酸同源性為93％，氨基酸同源性為90％；在BPI序列中，234，454，495，556位核昔酸有突變，核苷酸同源性為98％，氨基酸同源性為95％；在gB序列中，15，27，36，43，53，61，74位核苷酸有突變，核苷酸同源性為91％，氨基酸同源性為93％。結(jié)論：1．從肺炎患者中性粒細(xì)胞中，利用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)擴(kuò)增出BPIN端基因片段。2．將TAT、BPI基因片段克隆至IJpUC57載體中，并進(jìn)行PCR、酶切及DNA序列分析鑒定，
8、成功構(gòu)建了仉盯．BPI融合蛋白的原核表達(dá)載體。3．將gB基因片段克隆至UpTAT
