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1、健康人APOBEC3G基因的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定作者：甘宜敏，孔凡運(yùn)，史震，湯仁仙，鄭葵陽(yáng)【摘要】目的克隆人載脂蛋白BmRNA編輯酶催化多肽樣3G(apolipoproteinBmRNAeditingenzyme，catalyticpolypeptide3G，APOBEC3G)基因cDNA，構(gòu)建APOBEC3G基因的真核表達(dá)載體，并在體外進(jìn)行表達(dá)和鑒定。方法采用RT-PCR技術(shù)從健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞中克隆APOBEC3G基因，將該基因插入pcDNA3.1真核表達(dá)載體，構(gòu)建pcDNA3.1-A3G真核表達(dá)質(zhì)粒
2、，并利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-A3G轉(zhuǎn)染HepG2和HL7702細(xì)胞，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)、Westernblot等方法檢測(cè)APOBEC3G真核表達(dá)情況。結(jié)果雙酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果表明，APOBEC3G真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。免疫細(xì)胞化學(xué)和Westernblot結(jié)果均顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-A3G的HepG2和HL7702細(xì)胞APOBEC3G蛋白均高表達(dá)，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1和未轉(zhuǎn)染的HepG2和HL7702細(xì)胞APOBEC3G蛋白低表達(dá)或不表達(dá)。結(jié)論成功構(gòu)建了人載脂蛋白BmRNA編輯酶催化多肽樣3G真核表
3、達(dá)載體pcDNA3.1-A3G，為進(jìn)一步研究APOBEC3G抗HBV作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】APOBEC3G;克隆;真核表達(dá)載體 Abstract：ObjectiveToclonethecDNAofhuman10apolipoproteinBmRNAeditingenzyme,catalyticpolypeptide-like3G(APOBEC3G)geneandconstructtheeukaryoticexpressionvectorfortheinvitroexpressionandidentificati
4、on.MethodsThecodingregionofAPOBEC3GgenewasamplifiedbyRT-PCRfromperipheralbloodmononuclearcells(PBMCs)ofhealthyhumans,andthenthegenefragmentwasinsertedintotherecombinanteukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1toconstructtheeukaryoticexpressionplasmidofpcDNA3.1-A3G,whic
5、hwastransfectedintoHepG2andHL7702cells,respectively.TheexpressedproductsintheHepG2andHL7702cellsweredetectedbyimmunocytochemistryandWesternblot.ResultsTheresultsofdoubleenzymedigestionandsequencingshowedthatthepcDNA3.1-A3G-transfectedHepG2andHL7702cellswerebothh
6、ighlyexpressed,whilethecellstransfectedwiththeblankplasmidpcDNA3.1andthoseuntransfectedcellswerelowexpressedorunexpressed.ConclusionTheeukaryoticexpressionvectorofhumanAPOBEC3G,i.e.,pcDNA3.1-A3Gwassuccessfullyconstructed,whichlaysanexperimentalbasisforthestudyof
7、APOBEC3GagainstHBV. Keywords：APOBEC3G;clone;eukaryoticexpressionvector10 人載脂蛋白BmRNA編輯酶催化多肽樣3G(APOBEC3G)[1]是在研究HIV時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種RNA/DNA編輯酶，具有胞嘧啶脫氨酶活性，可使胞嘧啶(C)脫氨基變?yōu)槟蜞奏?U)，從而誘導(dǎo)病毒基因組發(fā)生堿基突變。其可抑制病毒感染因子(virioninfectivityfactor，vif)缺陷性(△vif)HIV-1在非允許細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、Hut68和人T淋巴瘤細(xì)胞系CEM
8、等)內(nèi)的復(fù)制，成為近年來(lái)逆轉(zhuǎn)錄病毒研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重大進(jìn)展。HBV雖不屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，但其有一個(gè)與HIV類(lèi)似的逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程。有研究表明APOBEC3G可抑制HBV復(fù)制[2-3]，但具體機(jī)制不明確。本實(shí)驗(yàn)從健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞中克隆APOBEC3G基因，并構(gòu)建該基因的真核表達(dá)載體，為后續(xù)研究APOBEC3G抑制HBV復(fù)制的作用機(jī)制
