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《人朊蛋白基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定-論文.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、2434重慶醫(yī)學(xué)2o14年7月第43卷第19期論著·基礎(chǔ)研究doi：10．3969／i．issn．1671—8348．2014．19．013人朊蛋白基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定張海英，劉亦恒。，費小雯，易西南，吳多慶。(1．海南醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，?？?7l101；2．海南省?？谑腥嗣襻t(yī)院骨科中心570208)摘要：目的構(gòu)建人朊蛋白基因(PRNP)真核表達(dá)重組質(zhì)粒。方法從阿爾茨海默病(AD)患者外周血白細(xì)胞中提取總RNA，利用RT—PCR的方法擴(kuò)增編碼人PRNP的基因片段，應(yīng)用基因重組技術(shù)將
2、人PRNP基因片段克隆到真核表達(dá)載體pEG—FP—N2中，經(jīng)XhoI及EcoRI雙酶切、單酶切及基因序列測定證實所構(gòu)建的載體。結(jié)果RTPCR方法獲得人PRNP的基因片段，限制性內(nèi)切酶酶切分析、PCR法及序列測定證實為正確重組質(zhì)粒，并且該重組載體能夠在sHsY5Y細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)論構(gòu)建的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEGFP—N2一PRNP通過鑒定，結(jié)構(gòu)正確，為后續(xù)研究PRNP的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：阿爾茨海默??；朊蛋白基因；pEGFP—N2真核表達(dá)載體中圖分類號：R592文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：167
3、18348(2O14)l9-243403BuildingandidentificationofpriongeneeukaryoticexpressionvectorofhumanZhangHaiying，LiuYiheng，F(xiàn)eiXiaowen，YiXinan，WuDuoqing(1．DepartmentofAnatomy，HainanMedicalUniversty，Haikou，Hainan57110l，China；2．DepantmentofOrthopaedic"，HaikouMunic
4、ipalPeoplesHospital，Haikou，Hainan570208，China)Abstract：ObjectiveToconstructaneukaryoticexpressionrecombinantplasmidnamedpEGFP—N2一PRNP．MethodsTotalRNAwasextractedfromalzheimer(AD)diseaseperipheralblood．a(chǎn)ndthePRNPgenewasamplifiedbyreversetranscription—
5、poly—merasechainreaction(RT—PCR)．Byusinggenerecombinationtechnique，humanPRNPcDNAwasinsertedintoretroviralvectorpEGFP-N2．TherecombinantplasmidwasidentifiedbyapairofspecifiedprimerscontainingtherestrictionsitesofXhoIandEcoRI．ResultsThePRNPgenecouldbeob
6、tainedbyRT—PCR，therecombinantplasmidwasidentifiedbyrestrictionendonucle—aseanalysis，PCRandsequenceanalysis，andtheexpressionvectorpEGFPN2一PRNP，whichcouldbestablyexpressedinSH—SY5Ycells．ConclusionTherecombinantplasmidpEGFP—N2一PRNPisconstructedsuccessfu
7、lly，WhichoffersabasicforthefurtherresearchonPRNPbiologicalfuction．Keywords：alzheimersdisease；PRNPgene；pEGFP—N2eukaryoticexpressionvector阿爾茨海默病(alzheimersdisease，AD)是一種以記憶和取試劑盒(QIAGEN公司)。認(rèn)知損害為主要特征的慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。主1．2方法要的病理改變?yōu)樵诖竽X皮層和海馬，出現(xiàn)大量老年斑和神經(jīng)纖1．2．1總
8、RNA的提取取AD患者靜脈血，提取細(xì)胞，川維纏結(jié)。因它的發(fā)病機制并清楚，從而無有效的治療手段。TRlzol試劑提取總RNA，測定其A260／A280吸光比值，計算有研究發(fā)現(xiàn)，A8寡聚體與神經(jīng)細(xì)胞膜上的細(xì)胞型的朊蛋白總RN人水平。(celllarprionprotein，PrP‘’)結(jié)合，增強了AB寡聚體的神經(jīng)1．2．2PRNP基[大1的獲得根據(jù)GenBankI=二人的PRNPcI)毒性。PrP是由染色體基組朊蛋白基因(prionproteinNA功能全長序列，設(shè)計一塒引物并導(dǎo)入XhoI和EcoR
