呆聰液對(duì)癡呆大鼠模型腦內(nèi)β淀粉樣前體蛋白基因表達(dá)的影響

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1、呆聰液對(duì)癡呆大鼠模型腦內(nèi)β淀粉樣前體蛋白基因表達(dá)的影響作者：岳啟安趙淑梅王紅艷閻樂(lè)法汲蕊宮英尤敏管福來(lái)錢(qián)震雯【摘要】目的探討呆聰液對(duì)癡呆大鼠模型腦內(nèi)β淀粉樣前體蛋白(βAPP)基因表達(dá)的影響。方法22月齡SD大鼠采用海人酸破壞腦基底核法造成學(xué)習(xí)和記憶功能障礙的癡呆動(dòng)物模型。造模后的大鼠隨機(jī)分為癡呆模型組、呆聰液(低、中、高劑量)組，同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組，每組10只。呆聰液低、中、高劑量組每日呆聰液灌胃(低5g/kg、中10g/kg、高20g/kg)，癡呆模型組和正常對(duì)照組每天用生理鹽水(10ml/k

2、g)灌胃，共1個(gè)月。通過(guò)水迷宮法和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)觀察呆聰液對(duì)癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和腦內(nèi)βAPP基因表達(dá)的影響。結(jié)果老齡癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，腦內(nèi)βAPP基因表達(dá)增強(qiáng)。呆聰液高、中、低劑量組能明顯提高學(xué)習(xí)記憶能力，降低腦內(nèi)βAPPmRNA含量，并有一定的量效關(guān)系，與癡呆模型組比較差異有顯著性(P<0.05)。結(jié)論呆聰液能改善老齡癡呆大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能，下調(diào)βAPP基因的表達(dá)?！娟P(guān)鍵詞】呆聰液;海人酸;動(dòng)物癡呆模型;β淀粉樣前體蛋白;基因表達(dá)7研究表明，老年癡呆患者都有腦

3、底動(dòng)脈硬化、海馬區(qū)額葉老年斑及神經(jīng)元纖維纏結(jié)的病理變化。中樞meynert基底核神經(jīng)元缺失伴膽堿能神經(jīng)元功能障礙，海馬區(qū)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性降低，可出現(xiàn)不同程度的腦萎縮。因此，中樞膽堿能神經(jīng)功能障礙與癡呆程度密切相關(guān)。為進(jìn)一步闡明呆聰液治療老年癡呆的作用機(jī)制，本文在研究呆聰液對(duì)老齡鼠癡呆模型腦M受體及免疫功能影響的基礎(chǔ)上〔1〕，探討呆聰液對(duì)老齡鼠癡呆模型腦M受體基因及β淀粉樣蛋白(Aβ)受體基因表達(dá)的影響?！　?材料與方法　　1.1動(dòng)物選用22月齡SD大鼠50只，體重250～300g，雌雄兼用，由山東

4、大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物試驗(yàn)中心提供?！　?.2方法　　1.2.1藥物、試劑與儀器呆聰液主要為人參、生地、知母、黃芪等組成，按中藥水提液的制備工藝加工制成，每毫升含生藥1g，由濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科配制加工而成;海人酸由濰坊醫(yī)學(xué)院生理教研室李秀艷教授饋贈(zèng);3%戊巴比妥鈉、乙醚、75%酒精、3%戊二醛、1%鋨酸等。江灣Ⅱ7型立體定位儀，PCR儀(美國(guó))，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)FOTODYNE公司)，電泳儀(美國(guó))?！　?.2.2模型制備將SD大鼠先用3%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)麻醉，然后固定于江灣Ⅱ型立體定位儀上，經(jīng)消

5、毒后正中矢狀切口，按照文獻(xiàn)〔2〕方法大鼠腦圖譜于前顱前2mm中線旁開(kāi)2.5mm處用自制打孔鉆打開(kāi)顱骨一小孔，固定移動(dòng)裝置，垂直進(jìn)入微型注射針頭7～8mm(即相當(dāng)于基底核區(qū))，輕輕注入1μg海人酸(1μg/μl)，靜留針1～2min后，緩慢移動(dòng)裝置退針，先用石蠟粉溶化后封住顱骨開(kāi)口，再在封口上撒適量青霉素和鏈霉素粉劑后縫合皮膚?！　?.2.3給藥方法將造模后的大鼠隨機(jī)分為癡呆模型組、呆聰液低劑量組(5g/kg)、中劑量組(10g/kg)、高劑量組(20g/kg)，每組10只，同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組。每日呆聰液

6、各劑量組灌胃相應(yīng)劑量呆聰液，癡呆模型組和正常對(duì)照組用生理鹽水(10ml/kg)灌胃，1個(gè)月后取腦標(biāo)本?！　?.2.4檢測(cè)指標(biāo)參照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)方法提取大鼠腦細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法測(cè)定總RNA濃度，A260nm/A280nm為1.8～2.0，提取總RNA于-70℃保存。引物的設(shè)計(jì)與合成：β淀粉樣前體蛋白(βAPP)mRNA，βactin通過(guò)Http://www.ncbi.nlm.nih.gov獲得cDNA序列，采用Primer5引物設(shè)計(jì)軟件，獲得PCR引物，引物由上海生工生物工程有限

7、公司合成。βAPP上游引物：(5′37′)AATCCTGCAGTACTGCCAAG,下游引物：(5′3′)TGGCAACAGTACTGCCAAG;βactin上游引物：(5′3′)CAACTTTACCTTGGCCACTACC，下游引物：(5′3′)TACGACTGCAAACACTCTACACC，產(chǎn)物150bp。RTPCR：用TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0。取適量總RNA稀釋至160μg/ml，65℃變性3min后，配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：MgCl22μl，10×RTBu

8、ffer1μl，RnaseFreedH2O3.75μl，dNTPMixture1μl，RnaseInhibitor0.25μl，AMVReverseTranscriptase0.5μl，Random9mers0.5μl，RNA1μl。30℃反應(yīng)10min，42℃反應(yīng)30min，99℃反應(yīng)5min，5℃反應(yīng)5min;PCR反應(yīng)液組成：5×PCRBuffer10μl，滅菌蒸餾水28.75μl，TaKaRaExTaQTMHS0.25μl，上游特異性PCR引物0