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《腦益康對阿爾茨海默病模型大鼠腦組織內(nèi)β淀粉樣蛋白及其產(chǎn)生通路的影響論文》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、腦益康對阿爾茨海默病模型大鼠腦組織內(nèi)β淀粉樣蛋白及其產(chǎn)生通路的影響論文繆麗莉周愛玲朱燕施海燕【摘要】目的通過建立阿爾茨海默病（Alzheimer'sdisease,AD）大鼠模型,觀察腦益康對AD大鼠學習記憶能力、β淀粉樣前體蛋白（β-amyloidprecursorprotein,β-APP）裂解途徑的影響，探討腦益康改善AD模型大鼠癥狀的機制。方法采用β淀粉樣蛋白毒性片段－(β-amyloidprotein25－35，Aβ25－35)海馬注射建立AD大鼠模型,用電迷宮刺激器檢測大鼠學習記憶能力；免疫組織化學方法觀察大鼠腦組織Aβ40/42表達的變化；逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶
2、鏈式反應(yīng)（reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR）方法檢測大鼠海馬β-APPmRNA表達情況；ICON公司)；BACE1抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；山羊抗兔IgG免疫組化試劑盒（北京中衫生物工程有限公司，批號：SP9001）；引物（上海捷瑞生物工程有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒﹑免疫印跡化學發(fā)光試劑（BeyoECLPlus）（均購自海門碧云天生物技術(shù)研究所）。1.3儀器大鼠腦立體定位儀（美國Stoelting公司）；Y-型（MG-B型）迷宮刺激器（張家港市三興教學機械廠）；冰凍切片機（LAIC
3、ACM1900，德國）；PTC-100PCR儀（美國Bio-rad公司）；Miniprotein-3電泳裝置（美國Bio-rad公司）；Trans-blot轉(zhuǎn)印槽（美國Bio-rad公司）。2方法2.1分組、造模與給藥用電迷宮刺激器篩選出學習記憶能力正常的SD大鼠48只，隨機分為6組：假手術(shù)組，模型對照組及陽性藥腦復(fù)康（0.4g·kg-1·d-1）對照組，腦益康小、中、大劑量組（1.73，3.45，6.90g·kg-1·d-1）。其中，腦益康中劑量相當于臨床用量，每組8只。將大鼠用10％水合氯醛（4ml·kg-1）腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位儀，顱頂部剪毛，碘酒和
4、酒精消毒后，無菌條件下切開皮膚，分離顱骨外骨膜，顯露前囟，記錄前囟A（矢狀軸）、L（冠狀軸）、V（垂直軸）的坐標，參照《大鼠腦立體定位圖譜》確定右側(cè)海馬CA1區(qū)位置，定位坐標：前囟后3.0mm，中線右側(cè)2.0mm，硬膜下4mm，在顱骨定位處鉆一小孔，緩慢垂直進針至靶點，然后將5μlAβ25－35(用生理鹽水將凍干粉狀A(yù)β25－35稀釋成2μg·μl-1,37℃下孵育1周，使其變?yōu)榫奂瘧B(tài)的Aβ25－35）緩慢注入，注射速度為0.5μl·min-1，留針5min，以保證溶液充分彌散，再緩慢撤針，無顱內(nèi)出血后縫合皮膚。假手術(shù)組注射等量生理鹽水，余操作同前。所有操作均在無菌條
5、件進行，手術(shù)后大鼠分籠飼養(yǎng)。于術(shù)后第2天開始灌胃給藥，1次/d，給藥容量為0.1ml·kg-1，腦復(fù)康腦益康均由0.5％羧甲基纖維素鈉配制灌胃，假手術(shù)組給予生理鹽水，模型對照組給予溶劑，連續(xù)30d。2.2迷宮刺激器實驗Y-型迷宮刺激器為三等臂式電迷路箱，三臂（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）間的夾角為120°，臂長48cm，寬16cm，高19cm，各臂末端均裝有信號燈。箱底鋪設(shè)銅柵，供通電刺激用。通過控制器開關(guān)，可使三臂交替作為安全區(qū)（不通電，燈亮）。于用藥30d后測試大鼠的學習、記憶能力。實驗固定在上午8：00～12：00進行，保持周圍環(huán)境安靜，避免強光刺激。將大鼠放入迷宮刺激器的一臂
6、，適應(yīng)環(huán)境3min后給予電刺激（60V，持續(xù)2s）。其余兩臂中的任一臂給予燈光信號，示為安全區(qū)。大鼠進入安全區(qū)，為正確反應(yīng)，否則為錯誤反應(yīng)。第2次訓(xùn)練以此安全區(qū)作為起步區(qū)，并使大鼠停留在安全區(qū)1min以鞏固記憶。再次給予電刺激，以此類推，按方向（Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ）依次改變安全區(qū)位置。學習測試：以測試達到連續(xù)10次中有9次（9/10）正確反應(yīng)前所需的電擊次數(shù)即嘗試次數(shù)表示學習能力。記憶再現(xiàn)測試：學習測試完成24h后以同樣方法進行，以達到9/10標準前的嘗試次數(shù)表示記憶能力。2.3取材方法和樣品制備將大鼠用20％水合氯醛腹腔麻醉后，剪開胸腔，暴露心臟，從左心室插灌注針至升主
7、動脈，用眼科剪剪開右心耳。先快速灌注生理鹽水150ml至流出液清亮，再灌注預(yù)冷的4%多聚甲醛500ml（先快后慢于1h內(nèi)灌注完）。灌注結(jié)束后迅速斷頭取腦，去除小腦和嗅球，4%多聚甲醛中后固定6～8h。將全腦依次移入含20%和30%蔗糖的磷酸鹽緩沖液中進行梯度固定，置于4℃冰箱中至組織塊沉燒杯底。取實驗所需部位于恒冷切片機中在-20℃下冰凍連續(xù)切片，片厚30μm。2.4免疫組織化學染色按免疫組化SP試劑盒方法進行Aβ40/42免疫組織化學染色，以0.01MPBS代替一抗做陰性對照，Aβ40/42免疫陽性細胞在光鏡下胞質(zhì)和突起內(nèi)有棕黃色陽性顆粒，計數(shù)每張
